Cancer-associated fibroblasts in brain metastases

Tese de mestrado. Oncobiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

As doenças oncológicas estão em vias de ser primeira causa de morte em países desenvolvidos. As metástases são responsáveis por cerca de 90% das mortes relacionadas com o cancro. A metastização é um processo complexo, que inclui invasão local, intravasação, circulação e sobrevivência, detenção num órgão distante, extravasação, micrometastização e colonização, no qual as células neoplásicas de um tumor primário disseminam para um órgão anatomicamente distante, adaptando-se ao novo microambiente. Em particular, as metástases cerebrais têm geralmente mau prognóstico, com diminuição da qualidade de vida e curta sobrevivência. A sua incidência está a aumentar devido à melhoria no controlo terapêutico dos tumores primários, à evolução dos exames imagiológicos e ao aumento da incidência dos casos de melanoma. As atuais estratégias terapêuticas para metástases cerebrais, que são agressivas e têm uma eficácia limitada, incluem resseção tumoral, radioterapia holocraneana, radiocirúrgia e quimioterapia. Tal como nos tumores extra-craneanos, o estroma tumoral tem um papel importante nesta patologia, uma vez que, fisiologicamente, o estroma cerebral é diferente do dos restantes órgãos, com células altamente especializadas. Os fibroblastos associados a cancro (CAFs) são células fusiformes com núcleos alongados, para os quais ainda não existe um biomarcador específico, uma vez que constituem uma população celular heterogénea, com diversas origens e diversos mecanismos de ativação. Uma vez desencadeados estes mecanismos, os CAFs têm um papel determinante na progressão tumoral. Não só servem de suporte biomecânico, como produzem fatores que condicionam o comportamento tumoral, nomeadamente proliferação, transição epitélio-mesenquimatosa das células neoplásicas, migração e invasão, bem como remodelação da matriz extracelular, inflamação crónica dos tecidos, evasão ao sistema imune, angiogénese, resistência à terapêutica e formação do nicho pré-metastático. À medida que as terapêuticas dirigidas ao estroma tumoral são exploradas e aplicadas com sucesso em tumores extra-craneanos, associado à pouca eficácia das terapêuticas atuais nas metástases cerebrais, cujos pacientes têm uma taxa de sobrevivência de 2,4% aos cinco anos após o diagnóstico, os CAFs surgem como um potencial e promissor alvo terapêutico. Uma vez que fisiologicamente não existem fibroblastos no cérebro, mas tendo em conta que têm um papel determinante da progressão tumoral, o objetivo deste estudo é identificar fibroblastos em 138 amostras fixadas em formol e impregnadas em parafina de metástases cerebrais de tumores da mama, cólon, pulmão, rim e melanoma, os tumores que mais frequentemente metastizam para o cérebro, usando um painel de sete marcadores imunohistoquímicos [Colagénios I, IV, VI e VII, anti-fibroblasto TE-7, α-actina do músculo liso (SMA) e CD34]. Como controlos foram usados 30 casos de glioblastoma, tumor cerebral primário, e 22 casos de parênquima cerebral considerado normal. De acordo com critérios de inclusão pré-definidos, foram observadas lâminas de arquivo de hematoxilina-eosina para seleção dos campos de interesse, com células tumorais e células do estroma morfologicamente compatíveis com fibroblastos. Foram criados 32 blocos de tissue micro array, com três cores por caso de metástase cerebral, um máximo de dezassete cores por bloco. Os blocos foram seccionados, tendo-se realizado a coloração de hematoxilina-eosina e as técnicas de imunohistoquímica em cortes de 3μm. As lâminas obtidas foram observadas por dois observadores independentes, especializados em neuropatologia. A marcação castanha de áreas do estroma foi considerada como marcação positiva, sendo posteriormente avaliada, segundo a sua intensidade, em fraca ou forte. As amostras foram microfotografadas e as áreas positivas foram medidas usando o software ImageJ. Considerando as áreas obtidas nas amostras dos controlos normais como um valor basal, este foi subtraído às áreas de marcação obtidas nas amostras tumorais, tanto das metástases como do tumor primário do cérebro. Foi realizada estatística descritiva usando o IBM SPSS e os gráficos foram feitos usando o SigmaPlot 12.0. Os resultados obtidos suportam a presença de CAFs nas metástases cerebrais estudadas, apesar de nem todos os anticorpos usados serem específicos para fibroblastos. Todas as lâminas de hematoxilina-eosina obtidas mostraram estruturas e células compatíveis com a existência de CAFs na amostragem analisada. A maioria dos marcadores usados foram extensamente positivos para a quase totalidade das amostras estudadas, com 95,5% de positividade para o Colagénio I, 84,3% para o Colagénio IV, 80,5% para o Colagénio VI, 75,8% para o anti-fibroblasto TE-7, 99,1% para a SMA e 100,0% para o CD34. O Colagénio VII marcou apenas 3,4% das amostras, pelo que não forneceu informações pertinentes à questão em estudo. Os anticorpos Colagénio I, SMA e CD34 apresentam uma imunorreatividade fortemente positiva na maioria das amostras, enquanto que o Colagénio IV e Colagénio VI, bem como o anti-fibroblastos TE-7, foram fracamente positivos. O Colagénio I foi o anticorpo com maior área de marcação, seguido do Colagénio IV, Colagénio VI e anti-fibroblastos TE-7. A SMA e o CD34 apresentaram menores áreas de marcação, comparativamente aos valores basais dos controlos normais. O Colagénio I é o colagénio mais abundante no corpo humano e putativamente sintetizado pelos fibroblastos. Uma vez que os tumores atuam como feridas que nunca cicatrizam e que o Colagénio I é deveras importante nos processos de cicatrização, seria expectável que fosse positivo na maioria das amostras estudadas, o que foi confirmado pelos dados obtidos. O Colagénio IV marcou membranas basais dos vasos sanguíneos, embora também se tenha observado áreas difusas fracamente marcadas, que podem corresponder a áreas de degradação de Colagénio IV ou áreas de membranas basais atípicas devido ao processo anormal de angiogénese, já sugerido como importante nos processos de metastização. O Colagénio VI está frequentemente desregulado em tumores, sendo responsável por suporte estrutural, angiogénese, apoptose, proliferação, fibrose e inflamação. O anti-fibroblasto TE-7 tem sido estudado como potencial biomarcador de fibroblastos. No entanto, marcou apenas 75,8% das amostras estudadas, na sua maioria fracamente, o que pode refletir uma expressão diferencial e, possivelmente, mais específica que os outros marcadores utilizados. A sua marcação foi idêntica às obtidas com Colagénio I e Colagénio IV, embora menos extensa. A SMA, como esperado, marcou células de músculo liso presentes dos vasos sanguíneos e células aparentemente benignas de aspeto morfologicamente compatível com fibroblastos. O CD34 é um marcador de células endoteliais, e como estas células são uma das fontes de CAFs, pensou-se que seria útil na determinação da origem deste, sem contrapartida no nosso estudo. A identificação da presença de fibroblastos em metástases cerebrais conseguida neste estudo é apoiada por resultados semelhantes obtidos por outros grupos de investigação, mas englobando um número de amostras e de anticorpos substancialmente superior. O estudo teve algumas limitações, sendo a mais importante a ausência de um biomarcador específico para CAFs, embora parcialmente ultrapassado com a utilização de um painel alargado de anticorpos. Mais estudos sobre este assunto devem ser realizados. Alguns deverão recorrer à utilização de outros marcadores imunohistoquímicos, como a proteína específica de fibroblastos (FSP) 1. Igualmente, a contagem de células morfologicamente compatíveis com fibroblastos e o estudo de marcadores ao longo da linha evolutiva dos tumores (tumor primário, tumor metastático extra-craneano e metástase cerebral) deverão constituir outras tantas linhas de investigação. A identificação de fibroblastos em metástases cerebrais aumenta o conhecimento oncobiológico desta patologia. Uma vez que as terapêuticas atuais são limitadas e pouco eficazes, e que a terapêutica dirigida a componentes do estroma tem vindo a ser estudada e utilizada com sucesso em variados tumores primários e metastáticos, a presença de CAFs em metástases cerebrais revela um novo alvo terapêutico, que pode revolucionar os atuais standards terapêuticos.

Metastases are responsible for about 90% of cancer deaths and a major problem in cancer management. In particularly, the incidence of brain metastases, which are often a sign of poor prognosis, diminished quality of life and short survival, are increasing due to the better control of primary tumours, the evolution of imaging techniques and the incidence rise of melanoma. Actual strategies include whole brain radiotherapy, stereotactic surgery, surgical resection and chemotherapy, which are very aggressive and with limited effectiveness for the patient .Tumour stroma is a key player that can determine overall outcome in cancers throughout the body. Indeed, cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a complex and critical role in cancer progression, and there is still no specific biomarker for them. The main goal of this research project is to identify fibroblasts in tissue stroma of 138 formalin-fixed paraffin embedded samples of the most common brain metastases (lung, breast, colon, kidney and melanoma), using an extended panel of the following immunohistochemical markers: Collagen I, Collagen IV, Collagen VI, Collagen VII, anti-fibroblast TE-7, α-Smooth muscle actin and CD34. Our data provides compelling evidence for the presence of CAFs in most frequent brain metastases, as our findings are similar to previous published studies. A better understanding of the crosstalk between cancer cells and CAFs can lead to the development of novel therapeutic agents and strategies. The identification of these cells increases the oncobiological knowledge of brain metastases and, as stroma-targeted therapies are being exploited and becoming more popular in primary tumours and extra-cranial metastasis, its identification can arise new and useful strategies in brain metastases management.