Exploring the modulatory role of A2A receptors in oligodendrogenesis derived from neural stem/progenitor cells of the subventricular zone

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

Os oligodendrócitos são as células responsáveis pela formação de mielina no sistema nervoso central. A sua membrana rica em colesterol é capaz de revestir axónios, formando a bainha de mielina. A bainha de mielina é uma estrutura espiral multilamelar que protege e fornece isolamento elétrico aos neurónios, permitindo uma maior velocidade de transmissão de potenciais de ação e contribuindo para a sobrevivência neuronal. Apesar da sua importância, os oligodendrócitos são facilmente afetados por stress oxidativo, o que pode levar à desmielinização. Durante o desenvolvimento e no cérebro adulto, os oligodendrócitos diferenciamse a partir de células precursoras de oligodendrócitos. Estas células são um subtipo de célula glial, caracterizadas por expressar PDGFRα (Platelet-Derived Growth Factor α) e o proteoglicano NG2 (Neuron-Glial antigen 2). No cérebro adulto, estas células correspondem a 3 – 8 % do número total de células e são especialmente prevalentes no hipocampo e córtex. Em casos patológicos, as células precursoras de oligodendrócitos podem ser originadas a partir de células estaminais neurais. E é de salientar que a zona subventricular, um nicho rico em células estaminais neurais, é então também uma fonte de células precursoras de oligodendrócitos. Estas células precursoras são capazes de migrar até ao córtex, corpus callosum, estriado e fimbria-fornix. Células estaminais neurais são células multipotentes, capazes de autorrenovação, e que geram a maioria das células do sistema nervoso – neurónios, astrócitos, e oligodendrócitos. Estas células estaminais neurais podem dividir-se de três maneiras diferentes: simetricamente, originando duas novas células estaminais neurais, o que leva à expansão da população de células estaminais neurais e à sua autorrenovação; assimetricamente, originando uma célula estaminal neural e uma célula diferenciada, o que contribui para a manutenção da população de células estaminais neurais enquanto ao mesmo tempo permite a diferenciação de novas células; ou novamente simetricamente, originando duas células diferenciadas, o que leva a uma redução da população de células neurais estaminais e à produção aumentada de novas células neurais. A natureza destas novas células vai depender da ativação de vias de sinalização específicas e da presença de moléculas que induzam a diferenciação, podendo estas células ser neurónios (neurogénese) ou células gliais (gliogénese), sendo particularmente importante a formação de novos oligodendrócitos (oligodendrogénese). No cérebro adulto, as células estaminais neurais existem em zonas específicas, onde a neurogénese e oligodendrogénese são altamente reguladas. Estas zonas cerebrais onde estes processos ocorrem, ou seja, onde se podem encontrar as populações de células estaminais neurais, são os chamados nichos neurogénicos. Existem fundamentalmente dois nichos neurogénicos no cérebro adulto: a zona subventricular dos ventrículos laterais, e a zona subgranular do giro dentado do hipocampo. Especificamente, o nicho neurogénico da zona subventricular é capaz de produzir interneurónios olfativos a partir de neuroblastos que migram pela via rostromigratória e se diferenciam em interneurónios GABAérgicos e dopaminérgicos no bolbo olfativo. Este nicho é também capaz de originar oligodendrócitos na presença de um insulto desmielinizante, como acontece na esclerose múltipla. A esclerose múltipla é uma doença inflamatória desmielinizante na qual há morte celular de oligodendrócitos e, consequentemente, as bainhas de mielina no cérebro e na medula espinal estão danificadas, o que leva a falhas na comunicação neuronal. Não existe cure para a esclerose múltipla e a esperança de vida para indivíduos afetados é cinco a dez anos mais baixa quando comparada com a esperança de vida de indivíduos não afetados. Quando há um insulto desmielinizante (como na esclerose múltipla), existe morte celular, especialmente de oligodendrócitos. Como dito anteriormente, isto leva a que os neurónios fiquem desprotegidos e incapazes de comunicar normalmente. Quando isto acontece, células precursoras de oligodendrócitos originadas da zona subventricular e presentes no parênquima vão migrar para a zona afetada, onde se vão diferenciar, originando novos oligodendrócitos. No entanto, muitas vezes a taxa de produção de novos oligodendrócitos não é eficiente para colmatar o dano causado pelo dano desmielinizante. Com efeito, em casos como esclerose múltipla, parece haver um bloqueio da remielinização. Assim sendo, torna-se extremamente importante encontrar moduladores de oligodendrogénese que possam funcionar como novos alvos terapêuticos para tratar patologias desmielinizantes. É neste contexto que decidimos estudar a adenosina e os seus recetores. A adenosina é um nucleósido ubíquo, que desempenha funções importantes na transferência de energia, sob a forma de ATP e ADP; na transdução de sinais, como AMP cíclico; e em neurotransmissão, como neuromodulador. A adenosina tem também funções importantes na neuroproteção, e na regulação de sono e vigília, pressão sanguínea, humor, entre outros. Existem quatro recetores de adenosina: A1, A2A, A2B, e A3. Todos estes recetores estão acoplados a proteínas do tipo G que afetam a atividade do adenilato ciclase. Os recetores A1 e A3 estão acoplados à proteína Gi/o, que inibe a atividade do adenilato ciclase, inibindo a produção de AMP cíclico intracelular. Por outro lado, os recetores A2A e A2B estão acoplados à proteína Gs, que estimula o adenilato ciclase, levando a uma maior produção de AMP cíclico intracelular. Dados preliminares do nosso grupo mostram que a ativação do recetor A2A da adenosina estimula a neurogénese em culturas de células originadas da zona subgranular do giro dentado do hipocampo, mas não tem o mesmo efeito em culturas de células originadas da zona subventricular. Por outro lado, foi encontrada uma maior densidade e proliferação celular na zona subventricular em amostras postmortem de pacientes com esclerose múltipla. Assim, os objetivos deste trabalho foram traçar a expressão de células de linhagem oligodendrocítica ao longo dos dias em cultura e estudar o efeito da ativação ou bloqueio dos recetores A2A na oligodendrogénese originada da zona subventricular de rato. Para isso, utilizaram-se ratos Sprague-Dawley com 1-3 dias pós-natal, dissecou-se a zona subventricular e dissociou-se o tecido. As células foram então deixadas a crescer em condições proliferativas, na presença do fator de crescimento EGF (Epidermal Growth Factor), durante seis dias. Ao fim destes seis dias, as células deram origem a neuroesferas que foram então plaqueadas em lamelas revestidas com poli-D-lisina e colocadas em condições diferenciativas (sem EGF). Nestas condições, é originada uma cultura mista, com células estaminais neurais, células precursoras, neurónios, astrócitos, e oligodendrócitos. As células foram então incubadas com agonista e/ou antagonista dos recetores A2A durante dois, quatro, ou sete dias. Após estes períodos, foram realizados ensaios de imunocitoquímica e um ensaio enzimático. Em primeiro lugar, os resultados obtidos mostram que, ao longo dos dias em cultura, as células da linhagem oligodendrocítica se vão diferenciando, originando um número cada vez maior de células precursoras de oligodendrócitos e de oligodendrócitos. É de realçar que os resultados mostram que a ativação do recetor A2A promove a oligodendrogénese originada da zona subventricular. Especificamente, a ativação do recetor A2A aumenta o número de células positivas para Olig2 (fator de transcrição expresso em todas as células da linhagem oligodendrocítica) a dois e quatro dias in vitro; assim como o número de células positivas para NG2 (marcador expresso em células precursoras de oligodendrócitos e em pré-oligodendrócitos) e o número de células positivas para GalC (galactocerebrósido, marcador expresso em oligodendrócitos imaturos e maduros) a dois e sete dias in vitro. Para além disto, observou-se que a ativação do recetor A2A leva a um aumento da atividade do enzima CNPase (2’,3’-Cyclic Nucleotide 3’-Phosphodiesterase), um enzima ligado à mielina e ao processo de mielinização, o que sugere que os novos oligodendrócitos formados são capazes de formar mielina, estando assim funcionalmente intactos. Deste modo é possível concluir que a ativação do recetor A2A tem um papel modulatório positivo na oligodendrogénese originada da zona subventricular, o que mostra que os recetores A2A podem ser alvos terapêuticos para doenças desmielinizantes.

Neural stem cells (NSCs) are self-renewing, multipotent cells that can generate most of the cells of the nervous system. In fact, NSCs exist in discrete regions of the adult mammalian brain entitled neurogenic niches, mainly located in the subventricular zone (SVZ) and in the subgranular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus (DG). Moreover, the SVZ is a source of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) that can migrate and populate the corpus callosum, striatum, and fimbriafornix in the adult mouse. Indeed, it has been shown an increased activation of the SVZ in post-mortem samples of multiple sclerosis (MS) patients. Given that MS is characterized by demyelination, this could imply that the SVZ is a source of OPCs that will migrate and differentiate into oligodendrocytes in the damaged regions, leading to a restored myelination. Due to the severe effects of MS, it is extremely important to explore possible therapeutic mechanisms. Adenosine is a neuromodulator with important roles in several physiological processes such as sleep and arousal, cognition, memory and learning, neuroprotection, and regulation of blood pressure and heart rate. Preliminary data from our group has shown that although A2A receptor activation stimulates neurogenesis from DG neural stem/progenitor cells cultures, it has no effect on neuronal differentiation from SVZ cell cultures. Therefore, this study evaluated whether A2A receptor activation could modulate oligodendrogenesis derived from SVZ NSCs. Results shown that A2A receptor activation promoted oligodendrocyte differentiation, as shown by an increase in the number of Olig2 (a transcription factor expressed throughout the oligodendrocytic lineage)-positive cells at 2 and 4 days in vitro and in the number of neuron-glial antigen 2 (NG2, expressed by OPCs, adult OPCs, and pre-oligodendrocytes) and galactocerebroside (GalC, expressed by immature and mature)-positive cells at 2 and 7 days in vitro. Furthermore, it was observed that A2A receptor activation leads to an increase in 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase (CNPase, a myelin-related enzyme expressed by mature oligodendrocytes) activity, which implies that oligodendrocytes were able to produce myelin. Taken together, our data suggest that A2A receptor activation has a positive modulatory effect on SVZ-derived oligodendrogenesis, which can be proven useful as a therapeutic approach for demyelinating disorders.