Novel therapeutic targets in colon cancer

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016

Colon cancer is a major health problem worldwide, representing the third most commonly diagnosed non-cutaneous cancer in men and the second most common in women. Interestingly, colon cancer-related deaths have decreased over the last decades. This is largely attributed to improvement in screening methods and shift in risk behavior. Only in 12% of the cases is mortality decline attributed to improved therapeutics. In addition, despite the accomplishments in colon cancer management, the metastatic form of the disease is the most commonly diagnosed and remains almost incurable. The implementation of new cytotoxic or targeted systemic agents, however, greatly improved current treatment options. Further, the belief is that the best therapeutic choice would be an appropriate combination therapy. Therefore, the discovery of new druggable targets is in high demand to improve colon cancer therapy, and multiple efforts have been undertaken to produce novel agents and to design novel combination therapies. The studies presented in this thesis were driven by the need to provide novel druggable targets, as well as suitable targeted delivery strategies for efficient and specific treatment of colon cancer. We explored the potential of cetuximab as a specific targeting agent to direct antibody-protamine conjugated and solid lipid nanoparticle systems, thoroughly designed to deliver microRNAs (miRNAs), to colon cancer cells. The results confirmed that cetuximab represents a successful specific targeting agent adequately supporting the development of the delivery tools. More importantly, our data demonstrated that the delivery systems are stable enough to reach target cells and be efficiently internalized. Further method development efforts resulted in a novel, simple and effective protocol that allows protein recovery from biological samples previously treated with TRIzolR and TRIzolRLS for RNA and/or DNA collection, thus surpassing the manufacturer’s limitations and improving extraction performance. In addition, this improvement greatly increases the amount of information extracted from a single sample. Finally, we hypothesized that ERK5 signaling represents a relevant protein and putative therapeutic target in colon cancer. ERK5 has recently been reported overexpressed in top-leading diagnosed cancers, and several lines of evidence suggest its potential deregulation in colon cancer. MiRNA-143, whose main target is ERK5 messenger RNA, is typically downregulated in colon cancer. Moreover, we have previously demonstrated that induced expression of miRNA-143, with concomitant repression of ERK5, contributes to reduced colon tumor growth and sensitization to 5-FU treatment. Remarkably, our results showed that ERK5 is aberrantly expressed in colon adenomas and adenocarcinomas, regardless of DNA mismatch repair system status, and that ERK5 overexpression correlates with more advanced and aggressive colon cancer. In addition, we demonstrated that ERK5 activation accelerates cell cycle progression and increases tumor cell migration via NF-κB activation, increasing its relevance as a potential druggable target. Further, in a mouse model, lymph node metastasis was exclusively seen in orthotopically implanted tumors with overactivated MEK5/ERK5 signaling, and not in tumors with inhibited MEK5/ERK5. In conclusion, the results presented in this thesis suggest two potential delivery strategies of small non-coding RNAs that are expected to unravel new therapeutic options for colon cancer; provide a protocol suitable for simultaneous isolation of proteins coupled to nucleic acid isolation; and unveil the role of ERK5 signaling as a novel relevant therapeutic target in colon cancer.

O cancro do cólon representa um grave problema de saúde pública mundial, sendo o terceiro tipo de cancro mais diagnosticado no homem e o segundo mais diagnosticado na mulher. A incidência mundial do cancro do cólon parece ter estabilizado desde 2005, atingindo atualmente 1.400.000 novos casos por ano e conduzindo a aproximadamente 700.000 mortes por ano. Curiosamente, a incidência de cancro do cólon em indivíduos com mais de 50 anos tem vindo a diminuir. Por outro lado, esta mesma incidência tem crescido na população mais nova, com menos de 50 anos, provavelmente em virtude do aumento da incidência de obesidade e de dietas inapropriadas. Existe, no entanto, uma grande discrepância geográfica quanto a incidência do cancro cólon, com a maioria das novas ocorrências em países desenvolvidos. Por outro lado, a mortalidade associada ao cancro do cólon e consideravelmente superior nos países em vias de desenvolvimento, em parte devido a falta de apoios médicos, que permitam o diagnóstico atempado dos tumores e a falta de consciencialização da população sobre comportamentos de risco. Apesar do grande desenvolvimento farmacêutico e médico, apenas em 12% dos casos a redução da mortalidade associada ao cancro do cólon e atribuída ao desenvolvimento de novos medicamentos. No que respeita ao tratamento, o cancro do cólon evoluiu substancialmente com a utilização do agente quimioterapêutico 5-fluouracilo. No entanto, a forma metastática da doença, que corresponde a maioria dos casos diagnosticados, permanece ainda praticamente incurável. A descoberta de novos alvos terapêuticos e estratégias de tratamento e urgente e tem sido o principal foco da investigação em cancro do cólon. Ao longo dos anos, a implementação de novos agentes sistémicos para o cancro do cólon, incluindo moléculas citotóxicas, como a oxaliplatina, ou direcionadas, como o cetuximab, aumentaram consideravelmente as opções terapêuticas. No entanto, a taxa de sucesso destes agentes nunca atingiu o pretendido e a implementação de terapias combinadas tem despertado grande interesse. E neste contexto que os microRNAs (miRNAs) apresentam um enorme potencial de aplicação terapêutica, uma vez que tem a capacidade de modular diversos alvos em simultâneo e, dessa forma, influenciar várias vias de sinalização. No entanto, a eventual aplicação dos miRNAs na terapia está longe de se concretizar, em parte, por não existirem até a data veículos capazes de transportar estes agentes especificamente para as células alvo. Um dos objetivos do presente trabalho foi o desenvolvimento de uma potencial ferramenta para direcionar e entregar agentes terapêuticos, como os miRNAs. Explorou-se o papel do anticorpo monoclonal cetuximab como agente de direcionamento específico do sistema conjugado anticorpo-protamina e de nanopartículas lipídicas sólidas, capazes de carregar e entregar miRNAs. O desenvolvimento destes sistemas terapêuticos pretende combinar o efeito terapêutico do cetuximab com o potencial dos miRNAs, procurando assim uma abordagem de terapia combinada. O sistema conjugado anticorpo-protamina implica a conjugação do cetuximab com um anticorpo de fusão com protamina. A protamina, por sua vez, apresenta afinidade para ácidos nucleicos, sendo capaz de transportar os miRNAs ate as células. Por outro lado, o sistema de nanopartículas lipídicas sólidas implica a funcionalização da superfície das nanopartículas lipídicas com o cetuximab, bem como o transporte de miRNAs no seu interior. Os resultados obtidos demonstraram que o cetuximab e capaz de atuar com sucesso, como agente de direcionamento específico dos nossos complexos terapêuticos para as células alvo. Mais ainda, os complexos produzidos são estáveis e eficientemente internalizados nas células alvo. Estas duas plataformas poderão, de futuro, ser utilizadas com vista a uma aplicação terapêutica de miRNAs. No presente trabalho foi também desenvolvida uma metodologia que permite o isolamento de proteínas totais a partir de amostras previamente tratadas com TRIzolR ou TRIzolRLS para extração de ácidos nucleicos. A metodologia desenvolvida e nova, simples e mais eficiente, aumentando enormemente a quantidade de informação recolhida a partir de uma única amostra biológica e ultrapassando as limitações do protocolo original. Esta nova metodologia foi crucial nos estudos seguintes, de descoberta de melhores alvos terapêuticos no tratamento do cancro do cólon. Vários membros da família das cinases MAPK tem surgido como alvos terapêuticos interessantes. No entanto, ate a data, o único fármaco aprovado para o tratamento do cancro foi o Trametinib, um inibidor da via de sinalização ERK1/2, utilizado no melanoma metastático. Curiosamente, a relevância do papel da ERK5, o membro das MAPK descoberto mais recentemente, tem crescido exponencialmente. A expressão e/ou ativação da ERK5 já foi reportada como estando aumentada em diversos tipos de tumores, para alem de ter sido associada a um pior prognostico. No entanto, o papel da ERK5 no cancro do colon encontra-se ainda por desvendar, apesar de diversas evidências apontarem também para a sua desregulação neste tipo de tumor. De facto, o miRNA-143, cujo principal alvo e o RNA mensageiro da ERK5, encontra-se tipicamente reduzido em tumores de cancro do cólon. Para além disso, a indução da expressão de miRNA-143, com consequente redução dos níveis de ERK5, esta associada a um melhor prognóstico, verificando-se diminuição do crescimento tumoral e sensibilização ao tratamento. Surpreendentemente, os resultados demonstraram que a ERK5 se encontra sobreexpressa em adenomas e adenocarcinomas do colon e, mais ainda, que níveis elevados da expressão da ERK5 estão correlacionados com uma maior agressividade dos tumores. De facto, demonstramos que a ativação da via de sinalização da ERK5 acelera a progressão do ciclo celular e aumenta a migração de células tumorais do colon, por intermédio da ativação da via do NF-κB. Estes resultados corroboram a relevância da via da ERK5 como potencial alvo terapêutico no cancro do colon. Em suma, os estudos apresentados nesta tese propõem duas estratégias de entrega de agentes terapêuticos, que poderão proporcionar o desenvolvimento de novas opções de tratamento no cancro do cólon; permitem o estabelecimento de um protocolo otimizado de recolha simultânea de proteínas e ácidos nucleicos de amostras biológicas tratadas com TRIzolR ou TRIzolRLS; e, por fim, desvendam o potencial papel da via da ERK5 como novo alvo terapêutico no cancro do cólon.