Structural proteins of enveloped virus : from biochemistry to molecular medicine : a focus on dengue virus

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016

Dengue virus (DENV) is an underestimated threat to Europe. Every year it infects arround 390 million people worldwide with 20 000 deaths. Due to climate changes, DENV has spread to all southern Europe, which raised awareness by the european authorities for the Control and Prevention of infectious diseases.The development of efficient and effective strategies to fight and control DENV strongly depend on how much knowledge we have regarding DENV life cycle, which is still poor. Disease control in affected areas is though limited to insect vector population control. Currently, there is no available treatment against DENV. This work reviews the role of DENV capsid protein during infection/entry of the virus into the host cell. It identifies and describes a novel function for flaviviruses Capsid proteins, supercharged proteins that have the ability to translocate/penetrate cells. This finding suggests and proposes new hypothesis in DENV life cycle. During such study, two domains were identified, pepR and pepM, which maintained the translocation ability of the native Capsid protein.The mode-of-action for membrane translocation was assessed and we concluded that the Capsid protein and pepM entry is through direct translocation whereas pepR uses endocytosis as entry gateway. The biotechnological translation and application of these molecules as drug delivery systems was evaluated using such molecules to deliver siRNA molecules to fight chronic myeloid leukemia. pepM revealed to be a very promising candidate to deliver such molecules, while both pepM and pepR demonstrated anticancer activity per se. The discovery of CPP in DENV proteins prompted the more extensive search of novel membrane-active peptide sequences in viral proteins. We used bioinformatic tools to identify potential protein fragments with antimicrobial and cell-penetrating properties. These sequences were mainly found in Capsid proteins of viruses. In conclusion, the identification of membrane translocation properties embedded in viral proteins suggests that this infectious characteristic is intrinsic of viral proteins, and these should play a role during infection. These membrane-active sequences from viral proteins also revealed as an underexplored pool of novel bioactive molecules to be applied in biomedicine and biotechnology drug development.

O vírus da dengue (DENV) é uma ameaça subestimada para a Europa. Este infecta 390 milhões de pessoas e mata cerca de 20 mil por ano. Devido às alterações climáticas, o DENV começa a espalhar-se por todo o sul da Europa; o que é uma situação preocupante reconhecida pelo Centro Europeu de Prevenção e Controlo das Doenças. A eficiência das estratégias para o controlo do DENV estão criticamente dependentes do nível de conhecimento acerca do ciclo de vida do DENV, o que é ainda precário. O controlo da doença nas áreas afectadas é limitado ao controlo da população de mosquitos vetores. Actualmente, não existem tratamentos eficazes disponíveis. Este trabalho estuda o papel da proteína da cápside do DENV durante a infecção/entrada do vírus na célula do hospedeiro, à luz da literatura actual. Uma nova função nas proteínas da cápside dos Flavivirus é identificada e descrita, proteínas supercarregadas que apresentam a capacidade de translocar membranas celulares. Esta propriedade sugere novas hipóteses e actualizações no ciclo de vida dos Flavivirus. Durante o estudo da proteína da cápside, dois domínios da mesma foram estudados, pepR e pepM e conservaram a capacidade translocadora identificada na proteína nativa. Os mecanismos de entrada foram avaliados e observou-se que a proteína da cápside e o pepM usava translocação directa, enquanto que o pepR recorria a mecanismos de endocitose. A aplicabilidade biotecnológica destas moléculas foi explorada desenvolvendo um conjugado que envolvia a combinação de pepR ou pepM com moléculas de RNA de interferência como possível terapia para a leucemia mielóide crónica. O pepM revelou-se um forte candidato para a entrega destas moléculas, e ambos pepR e pepM mostraram ainda propriedades anticancerígenas per se. A descoberta de CPP em proteínas virais, motivou a pesquisa mais profunda de novas sequências de péptidos no proteoma viral. Recorreram-se a ferramentas bioinformáticas para procurar principalmente domínios antimicrobianos e translocadores em proteínas estruturais de vírus. Observou-se uma predominância de sequências com estas propriedades nas proteínas da cápside. Concluindo, a identificação de propriedades translocadores sugere que o princípio de parasitismo está intrínseco nas proteínas virais e que estes domínios deverão ter uma acção preponderante na infecção. Estes domínios de proteínas virais fornecem também uma oportunidade biotecnológica valiosa para o desenvolvimento de novos fármacos.