Towards the therapeutic use of regulatory T cells for the treatment of human autoimmune diseases

Tese de doutoramento, Medicina (Imunologia Clínica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016

Regulatory T Cells (Treg), constitutively expressing the transcription factor Foxp3/FOXP3, play a crucial role in maintaining self-tolerance, assuming particular relevance in the context of autoimmunity. Adoptive transfer of Treg has been shown to be highly efficient in the prevention and treatment of autoimmunity in rodents and clinical trials exploring Treg-based adoptive therapy in Type I Diabetes (T1D) are currently ongoing. These therapies require large numbers of Treg, stressing the importance of a better knowledge of the molecular and cellular requirements for human thymic and peripheral Treg development. Moreover, widespread application of Treg-based therapy dealt with several limitations regarding the stability and function of in vitro expanded populations for in vivo use. The creation of efficient protocols enabling stable FOXP3 acquisition by human non-regulatory cells could overcome the limited availability of thymus-derived (t)Treg and would facilitate the generation of antigen-specific Treg, an ideal candidate in autoimmune diseases (AID) setting. The overall objective of this work was to provide new insights into the principles dictating human thymic and peripheral Treg development and homeostasis, thus facilitating the progress of Treg-based immunotherapy. First, we proposed to investigate the capacity of human non-regulatory memory CD4+ T cells to differentiate in vitro into bona-fide FOXP3-expressing cells and to assess the role of the Notch signaling pathway in modulating this conversion. We showed that stable and functional bona-fide Treg can be generated from memory CD4+ T cells and that Delta like (DL)1-mediated Notch signaling activation enhanced this conversion. We additionally showed that DL1 increased Treg proliferation, reinforcing the possible role of Notch in the homeostasis of the human peripheral Treg compartment. Importantly, we also demonstrated that DL1 enhanced the expression of function-related molecules within these cells, contributing to the maintenance of their regulatory phenotype. In order to better clarify the principles governing Treg development in the human thymus, we investigated the role of common gamma-chain (c) cytokines in human tTreg differentiation. We identified interleukin (IL)-2 and IL-15 as key molecular determinants in this process and excluded a major function for IL-4, IL-7 and IL-21. Moreover, we revealed that IL-2 and IL-15 are expressed in a non-overlapping pattern in the human thymus, with the former produced mainly by mature αβ and γδ thymocytes and the latter by monocyte/macrophages and B lymphocytes. Overall, this work has provided a better understading of the core mechanisms governing human Treg differentiation and homeostasis that should facilitate the further establishment of Treg-based therapies.

As Células T Reguladoras (T Regs), expressando constitutivamente o factor de transcrição Foxp3/ FOXP3, desempenham um papel crucial na manutenção da auto-tolerância, assumindo particular relevância no contexto de auto-imunidade. A transferência adoptiva de T Regs demonstrou ser altamente eficaz na prevenção e no tratamento de autoimunidade em roedores e ensaios clínicos explorando terapêuticas baseadas em T Regs na Diabetes Tipo I estão actualmente em curso. Estas terapias exigem um grande número de células, pelo que é essencial um melhor conhecimento dos requisitos moleculares e celulares para o desenvolvimento no timo humano e na periferia de T Regs. Além disso, a aplicação generalizada desta terapêutica tem ainda várias limitações no que respeita à estabilidade e função das populações expandidas in vitro para utilização in vivo. A criação de protocolos eficientes que permitam a aquisição estável de FOXP3 por células não-reguladoras poderá ultrapassar a disponibilidade limitada de T Regs de origem tímica e facilitar a geração de T Regs com especificidade antigénica, potencialmente ideais no contexto de doenças auto-imunes. O objetivo global deste trabalho foi investigar os princípios que ditam o desenvolvimento tímico e periférico e a homeostasia das T Regs humanas, facilitando assim o progresso da imunoterapia utilizando T Regs. Em primeiro lugar, propusemo-nos investigar a capacidade das células T CD4+ de memória não-reguladoras para se diferenciarem in vitro em células que expressam FOXP3, avaliando o papel da via de sinalização Notch na modulação desta conversão. Revelámos que T Regs estáveis e funcionais podem ser geradas a partir de células T CD4+ de memória isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis e que a activação de Notch mediada por DL1 aumenta esta conversão. Adicionalmente, demonstrámos que DL1 aumenta a proliferação de T Regs circulantes, reforçando o possível papel de Notch na homeostasia do compartimento periférico de T Regs. Mostrámos também que DL1 aumenta a expressão de moléculas relacionadas com a função de T Regs circulantes, contribuindo para a manutenção do fenótipo das T Regs. Com a finalidade de clarificar os princípios que regem o desenvolvimento de T Regs no timo humano, investigámos o papel das citocinas que utilizam um receptor com cadeia gama comum na diferenciação de T Regs humanas. Identificámos as interleucinas IL-2 e IL-15 como determinantes moleculares chave neste processo, tendo sido excluída uma função de relevo para IL-4, IL-7 e IL-21. Mais ainda, revelámos que IL-2 e IL-15 são expressas num padrão não sobreposto no timo humano, sendo a primeira produzida principalmente por timócitos maduros αβ e γδ e a última por monócitos/ macrófagos e linfócitos B. Em conclusão, este trabalho proporcionou um melhor conhecimento dos mecanismos fundamentais que regem o desenvolvimento, a homeostasia e manipulação in vitro das T Regs em humanos, contribuindo para o estabelecimento das terapêuticas baseadas em T Regs.