The impact of the phytopathogen Pectobacterium carotovorum in Drosophila melanogaster development

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Cell-to-cell communication or quorum sensing is an important bacterial process of intercellular communication that enables bacteria to determine their numbers by producing, secreting and detecting the accumulation of signalling molecules, called autoinducers. This process allows bacterial populations to synchronize gene expression and coordinate, at the group level, complex behaviours such as antibiotic production, biofilm formation or virulence. Pectobacterium carotovorum are Gram-negative bacteria which inhabit the soil and infect vegetables, causing large economic problems. Production of virulence factors in this specie is tightly regulated by two quorum sensing mechanisms: ExpI/ExpR system which uses the N-acyl homoserine lactone signal; and the GacSA/Rsm system in which the signal is unknown. Ecc15 is a strain of P. carotovorum that is able to persist in the gut, when oral ingested, by Drosophila melanogaster larvae. This persistence ability was attributed to the acquisition of a gene denominated Erwinia virulence factor (evf). Although the host immune response to this bacterium was extensively studied, the effect at the host development level upon bacterial infection was never addressed. Additionally, the genetic network controlling evf expression and the Evf specific mechanism of action in the gut remains poorly understood. In this work we studied the effect of the exposure to Ecc15 in the host development by following the time to pupation of larvae exposed to bacteria. We also investigated the Evf specific mechanism of action in the context of the host-microbe interaction by testing the effect of bacterial free supernatants and purified Evf protein. Moreover, we investigated the genetic network regulating evf transcription by monitoring the expression of the promoter regions of the known and putative regulators of evf (hor and evr, respectively). Finally we studied the role of quorum sensing and evf possible regulators in this specific interaction by exposing larvae to mutants in these genetic systems. In conclusion we observed that larvae exposed to wild-type Ecc15 have a development delay of approximately one day and that this effect is evf-mediated. We concluded the evf-effect is caused by interruption of feeding behaviour and that the product of the evf gene is not extracellularly toxic. In addition, we optimized a method to construct mutants in Ecc15 that allowed us to elucidate part of the genetic network involved in regulation of evf. Lastly we showed the role of the quorum sensing in the evf-mediated effect of Ecc15 in Drosophila development in vivo

Na maior parte dos casos, em ambientes naturais, os microrganismos fazem parte de uma comunidade grande e diversa. Assim como os Humanos desenvolveram a linguagem em resposta à necessidade de comunicação entre indivíduos, os cientistas descobriram que as bactérias também são capazes de comunicar umas com as outras através de sinais químicos. A comunicação célula-a-célula, ou quorum sensing, é um importante processo bacteriano que permite às bactérias determinar a sua densidade populacional através da produção, secreção e deteção de moléculas sinalizadoras chamadas auto-indutores. Este processo permite que as populações bacterianas sincronizem a expressão de genes e coordenem complexos comportamentos de grupo, como a produção de antibióticos, formação de biofilmes ou virulência. Pectobacterium spp. são bactérias Gram-negativas que habitam o solo e causam a doença da podridão mole em legumes. Estes agentes fitopatogénicos infetam diversos vegetais tais como batatas, cenouras ou aipos, causando importantes perdas económicas e de produção agrícola. A virulência desta bactéria está associada à produção de enzimas que degradam a parede celular. Estas enzimas são produzidas em elevadas quantidades e secretadas para o meio extracelular, resultando na maceração dos tecidos vegetais. Apesar do potencial virulento destas enzimas, a sua produção implica grandes custos energéticos para as bactérias. Portanto, de forma a serem efetivas, a sua produção é altamente regulada por dois sistemas de quorom sensing: o sistema ExpI/ExpR que usa as homoserinas lactonas aciladas como moléculas sinalizadoras e o sistema GacSA/Rsm cujo sinal é ainda desconhecido. O sistema ExpI/ExpR é um sistema de quorum sensing do tipo LuxI/LuxR, composto por uma sintetase de homoserinas lactonas ExpI e por dois recetores ExpR1 e ExpR2. As homoserinas lactonas têm a particularidade de se difundir livremente através da membrana e a sua concentração depende da densidade populacional. A baixas densidades celulares, quando a concentração de homoserinas lactonas é baixa, os recetores ExpR1 and ExpR2 ligam-se à região promotora da proteína reguladora RsmA estimulando a sua expressão. Esta proteína liga-se ao RNA de vários alvos, incluindo o das enzimas que degradam os componentes da parede celular vegetal, promovendo a sua degradação e reprimindo a virulência. Num cenário de altas densidades celulares, quando a concentração de homoserinas lactonas aumenta, estas ligam-se aos recetores, levando à restrição da interação DNA-proteína, que resulta na diminuição da expressão de rsmA e assim promovendo a expressão dos genes associados à virulência. O sistema GacSA/Rsm é um sistema canónico de dois componentes. É composto pela cinase sensora GacS e pelo regulador de resposta GacA. Apesar do sinal que despoleta a ativação deste sistema ser desconhecido, sabe-se que a ativação é dependente da densidade celular. Num cenário de alta densidade celular, a cinase GacS fosforila o regulador de resposta GacA promovendo a transcrição do RNA não codificante rsmB. Este sRNA liga-se à proteína RsmA inativando-a, o que resulta na ativação da expressão de genes relacionados com virulência. Assim, o sistema ExpI/ExpR e o sistema GacSA/Rsm coordenam a produção de fatores de virulência, como as enzimas que degradam componentes da parede celular vegetal, através da regulação dos níveis de RsmA e rsmB. Ecc15 é uma estirpe da espécie fitopatogénica Pectobacterium carotovorum que tem a particularidade de persistir no aparelho intestinal de Drosophila melanogaster quando ingerida oralmente. Esta capacidade foi atribuída à aquisição de um único gene denominado evf (erwinia virulence factor). Juntamente com este gene, dois reguladores foram identificados: hor uma proteína da família dos reguladores SlyA, e evr (erwinia virulence regulator) cujo papel na expressão de evf nunca foi investigado. Foi também descrito que a persistência da estirpe Ecc15 no intestino das larvas de Drosophila é um fenómeno transitório, em que a bactéria é eventualmente eliminada pelo sistema imunitário da larva. No entanto, numa fase crítica do desenvolvimento dos insetos, como é a fase larvar, uma infeção provoca o deslocamento dos recursos nutricionais de acumulação de reservas para ativação do sistema imunitário, o que pode ter consequências ao nível do desenvolvimento do hospedeiro. De facto, apesar de a resposta imunitária à infeção transitória causada pela estirpe Ecc15 ter sido intensamente estudada, a consequência desta para o desenvolvimento do hospedeiro nunca foi avaliada. Neste trabalho, propusemo-nos a estudar a rede genética que regula a transcrição do gene evf e o papel do quorum sensing na interação microrganismo-hospedeiro, com base na hipótese de que a expressão de evf é regulada por quorum sensing usando os componentes envolvidos na regulação da produção de factores de virulência associados à degradação das plantas. Para além disso, investigámos o efeito da exposição bacteriana no desenvolvimento do hospedeiro e o mecanismo de acção específico do Evf ao nível desta interação De modo a investigar o efeito da exposição à bactéria Ecc15 ao nível do hospedeiro, monitorizámos o desenvolvimento das larvas ao longo do tempo, em específico a passagem para o estádio de pupa, após infeção com Ecc15. Os resultados mostraram que larvas infetadas com a estirpe wild type (wt) de Ecc15 tinham um atraso no desenvolvimento, com apenas 50% das larvas a progredirem para pupa ao fim de 2 dias, em oposição às larvas controlo (alimentadas só com comida de mosca) com mais de 90% a atingirem o estado de pupa no mesmo período de tempo. Por outro lado, larvas infetadas com uma bactéria mutante no gene evf não mostraram qualquer atraso no desenvolvimento (93% tinham pupado ao dia 2) quando comparado com as larvas infetadas com a bactéria wt. Estes resultados revelam que a infeção transiente da bactéria Ecc15 provoca um atraso no desenvolvimento do hospedeiro e que este atraso é dependente do gene evf. Tendo em conta que a paragem de ingestão de comida é uma resposta comum durante uma infeção e que este comportamento pode causar problemas ao nível do desenvolvimento, monitorizámos a quantidade de comida ingerida pelas larvas após exposição à bactéria. As larvas foram infectas com a respetiva bactéria e postas em tubos contendo comida de mosca corada. A quantidade de comida ingerida foi inferida, quantificando a porção de pigmento azul ingerido 3 e 22 horas após infeção. Os resultados mostraram que 3 horas após o tratamento as larvas infetadas com a bactéria wt tinham ingerido pouca ou nenhuma comida quando comparado com as larvas infectas com o mutante evf ou com o controlo. Passadas 22 horas após infeção, pudemos observar pigmento nas larvas infetadas com a bactéria wt indicando que as larvas tinham retomado o consumo de comida. Estes resultados sugerem que a infeção que provoca o comportamento anormal das larvas foi eliminada, permitindo-lhes recomeçar a ingestão de comida de modo a prosseguir o desenvolvimento. Apesar de ter sido anteriormente postulado que o gene evf altera a fisiologia normal do hospedeiro cessando os movimentos peristálticos normais do intestino, o mecanismo específico pelo qual evf produz este efeito permanece desconhecido. Para perceber se o mecanismo de acção da proteína Evf ao nível do hospedeiro estaria relacionado com toxicidade extracelular, testámos sobrenadantes de uma cultura overnight e proteína Evf purificada no desenvolvimento das larvas. Foram analisados sobrenadantes de culturas wt, mutante evf, e Ecc15 wt a sobreexpressar o gene evf. Os resultados revelaram que nenhum dos sobrenadantes teve efeito ao nível do desenvolvimento larvar, com todas as larvas a comportaram-se de forma similar às larvas controlo. Suportando os dados dos sobrenadantes, a aplicação da proteína purificada também não teve um efeito relevante no desenvolvimento do hospedeiro. Estes resultados indicam que se a proteína Evf é uma toxina não é activa no meio extracelular, sendo provavelmente injetada no hospedeiro. Para estudar a rede genética envolvida na regulação da expressão do gene evf construímos, pela primeira vez, mutantes na estirpe Ecc15. Para isso usámos uma adaptação do método de recombinação descrito por Wanner e Datsenko. Escolhemos, como sendo os genes relevantes para compreensão da rede regulatória do evf, os genes expI e gacA como parte integrante da regulação por quorum sensing, e os genes hor e evr por serem conhecidos como reguladores de virulência. Sendo Ecc15 uma estirpe patogénica de plantas, os mutantes foram caracterizados para a expressão de fatores de virulência associados à degradação de componentes vegetais. Para isso usámos um protocolo para medir a maceração de batatas. Ambos os mutantes nos genes de quorum sensing (expI e gacA) apresentaram níveis de maceração muito baixos quando comparado com a bactéria wt, tal como os mutantes nos genes hor e evr. Curiosamente, o mutante evf apresentou níveis de maceração semelhantes ao wt. Estes resultados revelaram a importância do quorum sensing na expressão de genes associados à virulência em infeções de vegetais nesta estirpe bacteriana. Para além disso, mostraram que os genes hor e evr desempenham um papel na produção destes fatores ou em genes associados à sobrevivência na batata. Contrastando com a infeção das larvas, os resultados mostraram que o gene evf não tem qualquer papel na expressão dos fatores de virulência envolvidos na degradação das plantas, o que suporta a hipótese de aquisição génica especifica para a interação com a mosca da fruta. De forma a avaliar se a expressão do gene evf seria também regulada por quorum sensing fizemos fusões transcricionais com GFP (Green Fluorescent Protein) do gene conhecido como seu regulador (hor) e do regulador putativo (evr) e avaliámos a sua expressão ao longo do tempo. Para isso usámos citometria de fluxo e inferimos a expressão destes genes medindo a quantidade de GFP por célula em cada um dos mutantes. Os nossos resultados revelaram que num mutante expI a expressão génica (mais evidente no gene hor) está diminuída. Esta pode ser complementada adicionando homoserinas lactonas de forma exógena, o que é característico de regulação por quorum sensing. No entanto, os resultados também mostraram que o perfil de expressão de ambos os genes é diferente do perfil padrão de um gene regulado por quorum sensing. A expressão destes genes atinge o seu pico a meio da fase exponencial (4 horas de crescimento), contrastando com o observado normalmente em genes regulados por quorum sensing onde os picos de expressão ocorrem na fase estacionária. Os nossos resultados mostram que o quorum sensing tem um efeito na expressão destes genes in vitro, uma vez que a sua expressão é alterada na presença de homoserinas lactonas. No entanto, contrasta com a típica regulação por quorum sensing, já que na fase estacionária a expressão é reprimida por um mecanismo desconhecido. Por último, avaliámos o papel do quorum sensing e dos reguladores do gene evf no contexto do desenvolvimento in vivo. Para isso infetámos as larvas com os respetivos mutantes usando o protocolo descrito anteriormente. Em relação aos mutantes em genes de quorum sensing, os resultados mostraram que larvas infetadas com o mutante expI não tiveram qualquer atraso no desenvolvimento (87% de pupas ao dia 2) evidenciando uma dinâmica similar às larvas controlo. Por outro lado, as larvas infetadas com o mutante gacA apresentaram um fenótipo parcial, com um atraso no desenvolvimento (53% de pupas ao dia 2) significativamente diferente do controlo mas também do wt. Quanto aos mutantes nos genes reguladores do evf, larvas infetadas com o mutante hor não apresentaram qualquer atraso no desenvolvimento. Contrastando com este resultado, larvas infetadas com o mutante evr exibiram um fenótipo semelhante ao wt, com apenas 42% das larvas a atingirem o estádio de pupa ao dia 2. Isto revela que provavelmente este gene não tem um papel importante na expressão do gene evf. Coletivamente, estes resultados mostram que os genes expI e hor têm um papel importante no efeito causado por evf, assim como gene gacA parece ter uma função in vivo. No que toca ao gene evr os resultados indicam que não parece ter um papel relevante no efeito mediado por evf. Em suma, este trabalho elucidou o efeito da infeção transiente da bactéria Ecc15 no desenvolvimento da larva de mosca da fruta. Mostrámos que o efeito é causado por interrupção do comportamento alimentar normal e que o produto do gene evf não é toxico, pelo menos ao nível extracelular. Otimizámos ainda um método de construção de mutantes por recombinação homóloga em Ecc15 que nos permitiu elucidar parcialmente a rede genética reguladora da expressão do gene evf. Por fim mostrámos ainda o papel do quorum sensing in vivo, embora não tenha ficado completamente esclarecido se o efeito é direto, afetando o gene evf ou indireto, comprometendo a capacidade da bactéria permanecer e sobreviver no interior do hospedeiro.