Antimicrobial activity of essential oils against multiresistant aeromonads and enterococci

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

fections in humans and animals. The emergence of multiresistant strains and biofilm formation in clinical and food industry settings are major problems to public health worldwide. In the present study, in order to contribute to the evaluation of alternatives to antibiotics/disinfectants, eleven commercial essential oils were assessed for their antimicrobial and anti-biofilm activity against four aeromonads and four enterococci, sampled from clinical and environmental settings, all of which presented a multiresistant phenotype. Evaluation of the antimicrobial activity by the disc diffusion method, led to the selection of lemongrass and thyme essential oils as the compounds presenting the highest inhibitory activities. Then, broth microdilution was used to assess minimum inhibitory concentrations for both essential oils, which were lower for aeromonads (0.05-0.20%) than for enterococci (0.20-1.56%), suggesting that the Gram negative bacteria under analysis must harbor a cellular mechanism, or target, highly susceptible to the action of the aforementioned essential oils. The effect of lemongrass and thyme essential oils was also tested on previously formed biofilms using an adaptation of the Calgari Biofilm Device. The biofilms were subjected to 30 minutes or 1 hour of exposure to each essential oil and the results were assessed by colony counting. The essential oils showed high levels of eradication-ability against Aeromonas biofilms, but were unable to successfully eradicate enterococcal biofilms in the tested concentrations. Thus, biofilms formed by the bacteria under analysis (Aeromonas - Gram negative and Enterococcus - Gram positive) must possess distinct characteristics which could help explain the different biofilm-eradication outcomes. In conclusion, essential oils applicability as antimicrobial agents was assessed against multiresistant bacteria and in the future they should be regarded as potential alternatives for antibiotics, disinfectants or detergents used in the clinical and food industry settings. Moreover, studies should be directed towards a better understanding of the mechanism of action of essential oils against bacteria and their toxicity to human cell lines.

Os membros dos géneros Aeromonas e Enterococcus são microrganismos ubíquos, presentes em variados ambientes, como água, solo, animais e plantas. Inicialmente, aeromonas foram caracterizadas como bactérias patogénicas de seres aquáticos, contudo, hoje em dia, são também consideradas como bactérias patogénicas emergentes que provocam infeções em humanos. Por seu lado, enterococos eram bactérias consideradas inofensivas e benéficas para os humanos, sendo muitas vezes utilizadas na indústria alimentar. Porém, tal como aeromonas, nas últimas décadas, emergiram como microrganismos causadores de graves infeções associadas aos cuidados de saúde. A problemática associada a estes dois géneros deve-se ao facto de estarem altamente disseminados no ambiente, existindo em elevados números na água e em alimentos, bem como com a sua capacidade de produzir fatores de virulência, de adquirir genes de resistência a antibióticos e de formar biofilmes. A produção de fatores de virulência com propriedades/ações distintas é de extrema importância durante o processo infecioso, uma vez que estes vão permitir a invasão das células do hospedeiro e a evasão às suas defesas. Nos últimos anos, o uso inadequado e abusivo de antibióticos em meio clínico, em veterinária, na agricultura e na produção animal provocou a emergência de estirpes resistentes a uma variada gama de antibióticos. Estudos de programas de controlo e vigilância de saúde pública concluíram que a maioria das infeções associadas aos cuidados de saúde é causada por estirpes multirresistentes a antibióticos, como por exemplo, enterococos resistentes à vancomicina. Adicionalmente, os membros destes dois géneros têm a capacidade de formar biofilmes, comunidades de microrganismos agregadas a superfícies e envolvidas por uma matriz polissacarídica. Estas comunidades conferem proteção acrescida contra condições ambientais desfavoráveis, como falta de nutrientes, stress oxidativo e mecanismos de defesa do hospedeiro, e além disso a matriz impede ou dificulta a entrada de agentes antimicrobianos. Assim, a presença de biofilmes em superfícies e/ou instrumentos utilizados tanto na indústria alimentar como nos hospitais, pode ser considerada como uma das proveniências de bactérias patogénicas responsáveis por contaminações cruzadas e/ou infeções em humanos. Atualmente, os processos de higiene e sanitização não são suficientes para eliminar os biofilmes. Este facto, aliado à ocorrência de microrganismos multirresistentes a antibióticos/desinfetantes, levou a uma crescente necessidade de encontrar estratégias para combater estes problemas de saúde pública. Desde a antiguidade que os produtos naturais extraídos de plantas têm sido usados pelos humanos com variados propósitos. Nomeadamente, os óleos essenciais, sendo compostos aromáticos, são utilizados na indústria alimentar como aditivos de sabor, em cosméticos, em medicamentos e até mesmo em detergentes. Para além disso, as suas propriedades antibacterianas, antifúngicas e antivirais são conhecidas há muitas décadas, sendo utilizados com esse fim em medicina tradicional por todo o mundo. Como os óleos essenciais são misturas de vários compostos, as suas propriedades antimicrobianas podem dever-se à interação destes compostos com múltiplos alvos celulares, tornando mais complexo para os microrganismos o desenvolvimento de mecanismos de resistência. Desta forma, no presente estudo, quatro isolados de aeromonas e quatro isolados de enterococos foram escolhidos com base no seu fenótipo de multirresistência, a partir de coleções bacterianas pré-existentes compostas por isolados provenientes de amostras clínicas e ambientais. Inicialmente, a atividade antimicrobiana de onze óleos essenciais (alecrim, alfazema, alho, artemísia, árvore do chá, coentros, curcuma, erva limeira, gengibre, poejo e tomilho) foi avaliada contra os isolados ambientais e clínicos multirresistentes de Aeromonas e Enterococcus, utilizando o método da difusão em disco. Os óleos essenciais com maior atividade inibitória contra os dois grupos bacterianos foram a erva limeira, o tomilho e a árvore do chá. Os diâmetros das zonas de inibição com enterococos foram relativamente menores (máximo: 26.7 mm) do que os das zonas de inibição obtidos para aeromonas (que atingiram os 42 mm), mas em ambos os casos, os óleos essenciais erva limeira e tomilho foram selecionados como os óleos mais promissores, sendo escolhidos para utilização nos ensaios subsequentes. De seguida, o método das microdiluições foi utilizado para determinar as concentrações mínimas inibitórias (CMI) e as concentrações mínimas bactericidas (CMB) dos dois óleos essenciais selecionados. Uma vez que os óleos não se misturam de forma homogénea com o meio de cultura, foi necessário utilizar um solvente para que a interação entre o óleo e os microrganismos fosse potenciada. O solvente escolhido foi agar 0.15% (v/v), uma vez que permitiu a obtenção de uma mistura homogénea e não apresenta toxicidade para o crescimento bacteriano. De uma forma geral, as concentrações mínimas de erva limeira e de tomilho necessárias para inibir o crescimento bacteriano foram menores para aeromonas (0.05-0.20%) do que para enterococos (0.20-1.56%). Assim, apesar de terem a dupla camada membranar característica das bactérias Gram-negativas que lhes poderia conferir maior resistência a estes compostos, deverá existir outro mecanismo ou outro alvo nos isolados de Aeromonas que os torna mais suscetíveis à atividade antimicrobiana dos dois óleos essenciais testados. Por último, foi avaliada a capacidade de erradicação de biofilmes por parte dos óleos essenciais de erva limeira e de tomilho, tendo sido utilizada uma adaptação do Calgari Biofilm Device que consistiu na utilização de tampas de microplacas com pinos onde os biofilmes se formaram. Após 24 horas para estabelecimento dos biofilmes, os mesmos foram colocados em contacto com diferentes concentrações de óleos essenciais (0.20-3.13%) e foram testados dois tempos de erradicação (30 minutos e 1 hora). Mais uma vez, os isolados de Aeromonas foram mais suscetíveis à ação dos óleos essenciais, apresentando elevados níveis de erradicação de biofilme a 3.13 e a 1.78% com 30 minutos de tempo de contacto, demonstrando que este período é suficiente para erradicar o biofilme. O isolado A206 foi o mais sensível, sendo que 0.78% de cada um dos óleos foi suficiente para a remoção de biofilme previamente formado. Os biofilmes de Enterococcus não foram erradicados quando submetidos ao contacto com o óleo essencial de erva limeira e apresentaram níveis muito baixos de erradicação sob tratamento com tomilho, independentemente do tempo de erradicação. Estes resultados podem dever-se às diferentes características dos biofilmes produzidos por estes dois géneros bacterianos, de modo que os primeiros sejam mais facilmente removidos pelos óleos, resultado a necessitar de comprovação futura. No geral, é importante realçar que uma das grandes desvantagens do presente estudo tem a ver com a inexistência de normalização para testes dirigidos à análise da atividade antimicrobiana de compostos naturais, o que dificulta a comparação e a confirmação da veracidade dos dados de forma inequívoca, como acontece com os testes de suscetibilidade aos antibióticos. Assim, apesar de os óleos essenciais não terem sido igualmente eficazes em biofilmes de Enterococcus em comparação com os de Aeromonas, os resultados obtidos demonstraram que os óleos essenciais são alternativas promissoras aos agentes antimicrobianos usados atualmente, em meio clínico e na indústria alimentar. No entanto, uma melhor compreensão dos mecanismos antimicrobianos envolvidos na atuação dos óleos essenciais sobre as bactérias e qual a sua toxicidade em linhas celulares humanas, são assuntos a necessitar de ser aprofundados em estudos futuros.