Topical bacteriophage therapy of the infected diabetic foot

Tese de doutoramento, Medicina (Medicina Interna), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Diabetes mellitus is a global epidemic, with an estimated 171 million diabetic patients worldwide. Diabetic wound infections, particularly diabetic foot infections (DFI), are a major source of morbidity and their treatment consumes a significant amount of medical economic resources. In addition to debridement, the current first-line treatment for DFIs is antibiotic therapy. However, an increasing number of antibiotic-resistant DFI cases require alternative treatments. One potential alternative is bacteriophage therapy (BT). The purpose of this study is to develop and evaluate a topicallydelivered bacteriophage treatment protocol (including formulation and dosage regimen) with potential efficacy in diabetic wound infections. The principles of wound infection management are discussed, and a comprehensive overview of DFI assessment and management is provided. The principles and current applications of BT are also examined, with particular regard to the potential for the inclusion of topical BT in the DFI therapeutic strategy. In order to provide a thorough understanding of the epidemiology of DFI, a transversal observational multicenter study was conducted. Forty-nine hospitalized and ambulatory patients were enrolled, and 147 microbial isolates, comprising 43 different species, were cultured. This survey enabled the identification, characterization, and clinical correlation of the main bacteria involved, thus allowing the choice of the bacterial targets (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii). These targets were chosen not only because of their frequency but also because of their association with multi-drug resistance. Following the epidemiological study, five previously morphologically and genetically characterized bacteria-specific lytic bacteriophages (S. aureus F44/10 and F125/10, P. aeruginosa F770/05 and F510/08, and A. baumannii F1245/05 bacteriophages) were tested against these strains. The bacteriophage spot test procedure was used, and their combination was shown to have broad host ranges for the different target bacterial species. Subsequently, the in vitro activity against planktonic cells and established biofilms was studied. Target bacteria during planktonic growth were challenged with their specific bacteriophages, which revealed effective, early killing at 4 hours, but this was followed by bacterial regrowth to pre-treatment levels within 24 hours. However, by using metabolic activity as a measure of cell viability within established biofilms, significant cell impairment following bacteriophage exposure was found when repeated treatment (every 4 hours) was applied. The greatest effects occurred in both planktonic and biofilm cells, showing a bacteriophage/bacterium input multiplicity (IM) of 10. These complementary studies on both planktonic cells and established biofilms allowed us to define a high IM (≥10) and a treatment protocol of multiple doses (every 4 hours for 24 hours). When in vitro testing showed the feasibility of the project and indicated the optimal dosage regimen, the opportunity to study the bacteriophage solutions led to the development of an animal model of diabetic wound infection, which was suitable for the evaluation of topical antimicrobial therapies. The Galiano et al. murine splinted, excisional wound-healing model was used as a template and further refined and adapted using male chemically induced diabetic Wistar rats. After every step of the procedure was optimized, a model was established, which accurately reproduced not only the healing of infected wounds in humans but also the current treatment standard of care, including sharp debridement. This led to the subsequent in vivo testing of the antimicrobial activity and wound-healing capability of the topically delivered bacteriophage protocol against wounds with S. aureus, P. aeruginosa, and A. baumannii infections, using single strains of the bacteria, the aforementioned animal model, and a previously optimized pig wound infection model. In conjunction with sharp debridement, the bacteriophage treatment effectively decreased bacterial colony counts and improved planimetric and histological parameters in S. aureus and P. aeruginosa infections, but was not as effective against A. baumannii. Although the improvements were more significant in the rodent model than in the porcine model, our results suggested that topically administered bacteriophage treatment when applied in conjunction with wound debridement may be effective in resolving chronic wound infections. Incidentally, the results of the in vitro and in vivo studies were not only complementary but also yielded similar microbiological results, further highlighting the consistency and efficacy of the protocol across the tested scenarios. However, this project is not without limitations. Only one strain each of the bacteria was used in the in vivo testing, which meant that the effectiveness of the treatment was limited to these strains and cannot be universally assumed to be effective against related, similar, or other untested strains. Moreover, although the animal models are appropriate in terms of their biological similarity to humans, they fail to account for the full complexity of human DFIs, which could influence the effectiveness of the protocol. Furthermore, only one type of BT protocol was tested. It was demonstrably effective, but it may not be the most efficacious form of BT protocol. Additionally, bacteriophage resistance was not examined or tested, so even if the BT protocol is effective, this study cannot predict outcomes for all scenarios in which the BT protocol may be used. Nevertheless, collectively these studies show that a high IM (≥10) and multiple dose (every 4 hours for 24 hours), topical BT protocol may be an effective therapeutic approach to diabetic wounds infected with different pathogens, particularly those identified as antibiotic-resistant. These results represent the first step in the development of a fully regulated human clinical trial that explores the potential of BT in diabetic wound infections. The ultimate goal of this study is to transform BT into a viable, everyday strategy for treating DFIs.

A diabetes mellitus configura-se hoje como uma epidemia global, com uma estimativa mundial de cerca de 171 milhões de diabéticos. As infeções de feridas em diabéticos, particularmente as infeções do pé diabético, são uma importante fonte de morbidade, e representam uma significativa fonte de consumo de recursos médicos e económicos. A par do desbridamento mecânico, o atual tratamento de primeira linha para as infeções do pé diabético é a terapêutica antibiótica. No entanto, são cada vez mais as infeções por bactérias resistentes aos antibióticos, o que incita ao desenvolvimento de terapêuticas alternativas. Uma alternativa potencial é a terapêutica bacteriofágica. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento e avaliação de um protocolo de terapêutica bacteriofágica tópica (incluindo a formulação e posologia) com potencial eficácia no tratamento de infeções de feridas de diabéticos. São abordados os princípios gerais da terapêutica das infeções da pele e tecidos moles, com especial referência às infeções do pé diabético. Também os princípios gerais e as aplicações atuais e potenciais da terapêutica bacteriofágica são detalhados, destacando-se o potencial para a sua inclusão na estratégia terapêutica nas infeções do pé diabético. A fim de proporcionar uma visão global da epidemiologia das infeções do pé diabético, conduziu-se um estudo observacional, multicêntrico e transversal. Foram recrutados 49 doentes de ambulatório e em hospitalização, tendo-se isolado 147 microrganismos, pertencendo a 43 diferentes espécies. Este estudo permitiu a identificação, caracterização e correlação clínica das principais bactérias responsáveis pelas infeções do pé diabético, permitindo, assim, a escolha dos alvos bacterianos (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii). Estes microrganismos foram escolhidos não só pela sua frequência, mas também pela sua associação à resistência aos antibióticos. Na sequência do estudo epidemiológico, foram testados nestas estirpes cinco bacteriófagos líticos bactéria-específicos previamente caracterizados morfológica e geneticamente (bacteriófagos S. aureus F44/10 e F125/10, P. aeruginosa F770/05 e F510/08 e A. baumannii F1245/05), utilizando o procedimento de spot test para bacteriófagos. As combinações de bacteriófagos bactéria-específicos demostraram ter amplos host range para as diferentes espécies de bactérias-alvo. Posteriormente, a atividade destas combinações sobre células planctónicas e em biofilme maduro foi estudada in vitro. As bactérias-alvo em crescimento planctónico foram infetadas com diferentes combinações dos seus bacteriófagos específicos, obtendo-se eficácia inicial (nas primeiras 4 horas), porém, com recrescimento bacteriano para os níveis pré-tratamento em 24 horas. No entanto, em células de biofilmes maduros – usando a atividade metabólica como uma medida da viabilidade celular – obteve-se uma importante limitação da viabilidade após exposição repetida (a cada 4 horas) às diferentes combinações dos bacteriófagos específicos. Os maiores efeitos, tanto sobre células planctónicas como sobre as células em biofilme, ocorreu com uma input multiplicity de 10. Estes estudos complementares em células planctónicas e em biofilme maduro permitiram definir um protocolo terapêutico utilizando uma input multiplicity elevada (≥ 10) e múltiplas doses (a cada 4 horas durante 24 horas). Uma vez que os testes in vitro mostraram a viabilidade do projeto e indicaram a posologia ideal, a oportunidade de estudar as soluções de bacteriófagos levou ao desenvolvimento de um modelo animal de infeção da ferida diabética adequado para a avaliação das terapêuticas tópicas antimicrobianas. O modelo murino excisional de cicatrização de feridas com utilização de tala de Galiano et al. foi adaptado e aperfeiçoado, utilizando ratos Wistar machos com diabetes mellitus induzida quimicamente. Depois de otimizar cada etapa do processo, foi estabelecido um modelo que não só reproduz com precisão o processo de cicatrização de feridas infetadas em seres humanos, mas que reproduz igualmente o atual protocolo de tratamento destas feridas, incluindo o desbridamento mecânico. Isto levou ao subsequente ensaio in vivo – no modelo animal acima mencionado, bem como num outro modelo porcino de infeção de ferida previamente otimizado – da atividade antimicrobiana e da capacidade de cicatrização de feridas do protocolo de terapêutica bacteriofágica tópica em feridas infetadas por estirpes individuais de S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. A terapêutica bacteriofágica tópica, em conjunto com o desbridamento mecânico, resultou efetivamente na diminuição da contagem de colónias bacterianas bem como na redução da área de ferida e melhoria dos parâmetros histológicos em feridas infetadas por S. aureus e P. aeruginosa, não tendo sido demonstrada tanta eficácia nas infetadas por A. baumannii. Estes resultados, embora mais expressivos no modelo de roedor do que no modelo porcino, sugerem que a terapêutica bacteriofágica tópica, quando aplicada em conjunto com o desbridamento mecânico, pode ser eficaz na resolução de infeções de feridas crónicas. Aliás, os resultados dos ensaios in vitro e in vivo não só são complementares, como também apresentam resultados microbiológicos semelhantes, destacando a consistência e eficácia do protocolo entre os cenários testados. No entanto, este projeto não é isento de limitações. Apenas uma estirpe de cada uma das bactérias foi usada no teste in vivo, o que significa que a evidência da eficácia terapêutica é limitada a estas estirpes, não podendo ser assumida como eficácia universal, nomeadamente em estirpes não testadas. Ademais, e independentemente da similaridade biológica dos modelos animais com os humanos, eles não conseguem dar conta de toda a complexidade das infeções do pé diabético que pode influenciar a eficácia do protocolo. Além disso, apenas um tipo de protocolo de terapêutica bacteriofágica foi testado. Apesar de ter demonstrado eficácia, pode não ser o protocolo mais eficaz. Por fim, também a resistência aos bacteriófagos não foi avaliada, o que significa que, mesmo que o protocolo seja eficaz, o estudo não pode prever os resultados para todos os cenários em que o protocolo possa ser utilizado. Coletivamente, estes estudos demostram que um protocolo de terapêutica bacteriofágica tópica usando uma input multiplicity alta (≥ 10) e doses múltiplas (a cada 4 horas durante 24 horas) pode ser uma abordagem terapêutica eficaz para a terapêutica de feridas diabéticas infetadas por diferentes agentes patogénicos, especialmente aqueles associados a resistência aos antibióticos. Estes resultados representam um primeiro passo no desenvolvimento de um ensaio clínico controlado e regulamentado para a avaliação do potencial da terapêutica bacteriofágica nas infeções de feridas de diabéticos. O objetivo final deste estudo é transformar a terapêutica bacteriofágica numa alternativa viável para o tratamento das infeções do pé diabético.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Indústria Farmacêutica SA (Tecnifar)