The dynamics of fibroblasts/ECM in neonatal cardiac injury

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Cardiac diseases remain the major cause of morbidity and mortality worldwide. This is the ground for an increasing number of studies on the characterization of the heart’s response to injury and on the development of new therapies to functionally restore the damaged myocardium. Recently, several reports show that the mammalian heart, when injured in a shortperiod after birth, displays the capacity to regenerate, whereas, if injured after post-natal day (P)7, it triggers the formation of a non-functional fibrotic scar. However, the signals that determine the development of a reparative (adult) or regenerative response (neonate) are largely unknown. The premise of our Team is that the transient regenerative capacity of the heart is related to specific organ changes during this ontogenic period. The herein work focuses on the dynamics of cardiac fibroblasts and that of the extracellular matrix (ECM) during ontogeny and following injury in the neonate. We demonstrate that fibroblasts, here defined as the CD31-CD45-Ter119-CD90+ population, colonize the heart following birth and also that the cell-surface signature of this compartment changes throughout post-natal life. Our results demonstrate that the neonatal heart response to apex resection involves the recruitment of inflammatory cells, fibroblast activation, ECM production and neo-vascularization. High Content Analysis (HCA) revealed that the removed tissue was, at least in part, re-established by the proliferation of resident cardiomyocytes. Moreover, despite formation of scarring tissue (inner core of the injured area) and incomplete histological restoration, resected hearts were functionally competent at 21d post-lesion. Overall this work describes the microenvironmental alterations, with particular emphasis on fibroblasts and ECM, triggered following neonatal apex resection and that culminate on partial restoration of the organ.

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morte nos países de alto e médio rendimento. O transplante cardíaco é o único tratamento eficiente a longo prazo, no entanto, este é limitado pela baixa disponibilidade de dadores e a necessidade de imunossupressão. Após enfarte do miocárdio, a isquemia resulta em elevada morte celular por falta de oxigénio e nutrientes. Uma vez que o coração adulto é incapaz de restabelecer os cardiomiócitos perdidos, que são a força contráctil do coração, a função sistólica fica diminuída e desenvolve-se tecido cicatricial, como resultado de um processo reparativo, na região afectada pela isquemia. Consoante a extensão de tecido afectado pelo enfarte este pode ser fatal ou conduzir a uma perda progressiva de função. Contudo, no início do século XXI, vários foram os estudos que demonstraram que os cardiomiócitos proliferam na vida pós-natal, ainda que a uma taxa insuficiente para garantir a plena reconstituição do miocárdio após lesão. Esta evidência conduziu a comunidade cardiovascular a investigar sinais que possam levar ao melhoramento da resposta do coração ao enfarte, nomeadamente estimulando a proliferação de cardiomiócitos. Nesse sentido vários modelos animais foram estudados e constatou-se que o peixe-zebra (Danio rerio), o axolote (Amblystoma mexicanum) e o tritão (Notophthalmus viridescens) são capazes de recuperar histo-funcionalmente de lesões cardíacas induzidas experimentalmente, como é exemplo a remoção do ápice cardíaco. Embora estes estudos constituam a primeira evidência de que o coração tem potencial regenerativo, a longa distância filogenética entre estes animais e os mamíferos, questiona o potencial translacional destes estudos. Surpreendentemente, em 2011, Porrello et al. demonstraram que o murganho (Mus musculus) detém uma capacidade de regeneração cardíaca transiente, já que esta parece cessar após a primeira semana de vida. Após remoção do ápice em animais no primeiro dia de vida os autores reportam que o coração é restaurado com fidelidade a nível histo funcional. Contudo, quando a mesma lesão é praticada em animais após a primeira semana de vida verificava-se a formação de uma cicatriz fibrótica não funcional, semelhante à formada no órgão adulto após enfarte do miocárdio. Este estudo revolucionou a área cardiovascular uma vez que se considera que este é um modelo útil na identificação de factores importantes para melhorar o processo de reparação do coração adulto humano. Durante a realização deste trabalho, todavia, Andersen et al. (2014) refutaram a existência de regeneração cardíaca em murganho. Os autores verificaram que após remoção do ápice cardíaco há activação de uma resposta inflamatória exuberante, formação de uma cicatriz fibrótica e que os corações eram sistematicamente mais pequenos e apresentavam menor proliferação e vascularização que os respectivos controlos cirúrgicos. Estes resultados instalaram na comunidade cardiovascular uma atmosfera de incerteza quanto à reprodutibilidade do modelo de lesão neonatal e à capacidade regenerativa dos murganhos neonatais. O coração é composto por vários tipos celulares, nos quais se incluem os cardiomiócitos, elementos vasculares (células do músculo liso e endoteliais) e fibroblastos cardíacos. Atendendo à sua elevada frequência no estroma cardíaco, o papel dos fibroblastos cardíacos foi rigorosamente avaliado durante o normal funcionamento do coração e em resposta ao enfarte do miocárdio. Apesar da ausência de marcadores fidedignos deste tipo celular, uma vez que ainda não foi descrita uma assinatura molecular própria, sabe-se que estas células são essenciais para a preservação das propriedades físico-químicas do coração, sendo mesmo as principais responsáveis pela produção e secreção da matriz extracelular (ECM) cardíaca. Os fibroblastos cardíacos são também produtores de metaloproteinases (MMPs) que degradam a ECM e, como tal, este tipo celular é responsável por modelar a composição da matriz, o que por sua vez condiciona o comportamento das células aí residentes. Após enfarte do miocárdio, os fibroblastos cardíacos migram para o local da lesão, proliferam e diferenciam em miofibroblastos, os quais expressam ativamente marcadores de músculo liso e depositam colagénio tipo I e III, na região da lesão, gerando uma cicatriz fibrótica não funcional. Embora se conheça o papel dos fibroblastos cardíacos na lesão do coração adulto, o seu papel na lesão neonatal é totalmente desconhecido. A premissa da equipa Stem Cell Microenvironments is Repair/Regeneration do INEB é de que o carácter transiente da regeneração cardíaca resulta de alterações no coração quer ao nível da ECM quer ao nível celular durante a ontogenia do órgão. Neste trabalho, definimos como objectivos a avaliação da dinâmica da população de fibroblastos cardíacos e da produção de ECM ao longo do desenvolvimento e maturação do coração, bem como durante a resposta à remoção do ápice cardíaco. Usando esta estratégia pretendemos investigar se são apresentados/emitidos sinais pela ECM ou pelos fibroblastos cardíacos, que promovam a proliferação ou maturação de cardiomiócitos. Através do estabelecimento do modelo de ressecção do ápice cardíaco e caracterização histo-funcional do mesmo procuramos providenciar dados empíricos que permitam clarificar se ocorre efectivamente activação de processos regenerativos em resposta à lesão, nomeadamente processos de proliferação de cardiomiócitos. Contrariamente ao que foi descrito no trabalho pioneiro de Porrello, nas nossas condições, não foi observada a recuperação completa do ápice cardíaco até 60 dias após-cirurgia. Ao invés, detectou-se deposição de uma cicatriz fibrótica composta por colagénio, na zona central de lesão, ainda que sem impacto detectado na função cardíaca. As variações da componente celular e extracelular durante a lesão foram avaliadas através da co-detecção de marcadores celulares com proteínas da ECM. Imediatamente após a lesão foi possível observar uma disrupção dos padrões de expressão da α-actinina sarcomérica e das proteínas da lâmina basal colagénio IV e laminina na zona de lesão, padrões estes que foram parcialmente restabelecidos aos 21 dias após a lesão. Durante os primeiros 5 dias verificou-se uma forte resposta inflamatória, caracterizada por um elevado número de células hematopoiéticas. Todavia aos 7 dias após-lesão o número de células hematopoiéticas decresce significativamente e acentua-se a presença de fibroblastos e miofibroblastos. A expressão de fibronectina e tenascina-C no local de lesão parece inicialmente estar associada ao coágulo sanguíneo e às células hematopoiéticas, no entanto a partir dos 7 dias pós-cirúrgicos, a sua produção passa a ser assegurada pelos fibroblastos/miofibroblastos. Conseguimos eficazmente correlacionar a expressão de fibronectina e tenascina-C com a proliferação/mitose celular, uma vez que é nos locais onde estas proteínas abundam que há maior expressão de PH3. A análise quantitativa do número de células mitóticas permitiu identificar um maior número de células em mitose e mais especificamente de cardiomiócitos, em corações sujeitos a lesão. Uma vez que observámos activação e diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos após lesão, decidimos estudar o perfil destas células em maior detalhe. Como nunca foi reportada a caracterização de fibroblastos no período pós-natal, avaliámos o perfil de expressão dos fibroblastos, identificados com base na expressão de CD90, ao longo da ontogenia bem como num cenário de lesão. Os fibroblastos cardíacos instalam-se no miocárdio após-nascimento, de forma a constituírem cerca de 60% da população estromal do coração adulto. Adicionalmente, o perfil da população proliferativa no adulto parece ser na sua maioria composto por fibroblastos. Avaliámos a expressão de diferentes marcadores envolvidos na adesão celular e de afiliação mesenquimal na população de fibroblastos, o que salientou a heterogeneidade desta população e alterações do perfil de expressão dos diferentes marcadores ao longo da ontogenia. De salientar é a população Sca-1+, que aumenta de um nível residual a P2 para mais de 70% dos fibroblastos cardíacos (CD90+) no coração adulto. A população de fibroblastos cardíacos activados pela lesão é constituída maioritariamente por células Sca-1+ e CD44+, verificando-se ainda uma redução significativa da expressão de CD29 e de CD140a após lesão. No entanto, considerando o compartimento proliferativo, apenas se verificou-se um aumento na população Sca-1+. Em suma, demonstrou-se que a resposta do neonatal (P2) à lesão envolve a formação de um coágulo sanguíneo, recrutamento de células inflamatórias, proliferação de miofibroblastos, rearranjo da matriz extracelular e activação da proliferação de cardiomiócitos. A população de fibroblastos cardíacos surge como altamente heterogénea apresentando-se diferente consoante o período ontogénico e em resposta à lesão. A relevância funcional das alterações observadas após lesão e durante a ontogenia requerem investigação futura.