How hydrogen peroxide and CXCL8 modulate neutrophil recruitment "in vivo"

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Neutrophils are one of the major pathogen-fighting immune cells that belong to the innate branch of the immune system. These cells play an important role in inflammation due to their outstanding ability to be quickly recruited to sites of infection or injury and there, to recognize and phagocyte threats and then to kill pathogens through a combination of cytotoxic mechanisms. During the last decade neutrophils have been shown not to be simply terminally differentiated cells with a short life-span with a microbicidal function, but also crucial modulators of the adaptive immune response by acting as antigen-presenting cells, B cell “helpers” or T cell suppressors. Additionally the idea that neutrophils are “dead end” cells whose ultimate fate is death within inflamed tissues is currently under dispute by strong in vivo evidences of reverse neutrophil migration, both in zebrafish and mice. Importantly, neutrophils are involved in several autoimmune and chronic inflammatory diseases with increasing rates of incidence in our society. In this regard, dysregulation of the mechanisms that control the inflammatory response are often observed to be associated with persistent neutrophilic tissue infiltration and extensive host tissue damage in several diseases. Taken all this, it is currently crucial to expand our knowledge of the mechanisms governing neutrophil migration so as to more appropriately target specific key components and further advance in the development of more effective treatments for those diseases. In this thesis, we have focused our studies onto two main neutrophil chemoattractant molecules, the Cxcl8 and hydrogen peroxide (H2O2). CXCL8 is the prototypical member of the CXCL8/IL8-chemokine sub-family of CXC chemokines that acts on CXCR1 and CXCR2 receptors. CXCL8 was actually one of the first chemokine to be discovered and to due to its important biological role gave name to this sub-family. CXCL8 is mostly known as a potent chemoattractant for neutrophils, although it has also been shown to be involved in other processes such as leukocyte biology and function, angiogenesis and cancer. As for H2O2, this molecule was until recently extensively studied as one of the most important components of the neutrophil oxidative burst response against threats. In 2010, a new role was discovered for this harmful molecule in the zebrafish inflammation. Upon production by the Dual oxidase 1 (Duox1), H2O2 was shown to be released by the wounded tissue as an initial signal responsible for early neutrophil recruitment. Taken all this we aimed in this thesis to address the mechanisms underlying Cxcl8 and H2O2 expression/production and function in zebrafish inflammation and most importantly, to understand whether and how the action of these signals may be concerted so as to modulate neutrophil recruitment during the inflammatory response. Zebrafish is nowadays a very powerful and promising animal model. In particular, it has several features that make this small fish an amazing, if not unique, model for the study of neutrophil recruitment by non-invasive methods. The most important ones are: a complete sequenced genome; a high homology with humans; an immune system that is remarkably similar to mammalian counterparts after 4-5 weeks and that enable the study of innate immune responses independently of adaptive ones at earlier developmental stages; and the most captivating one, the transparency of their embryos that along with the large availability of transgenic lines allow in vivo tracking of specific cells. Importantly, the zebrafish has two true homologues of the mammalian CXCL8, namely Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2, which are absent from the mouse. We started by asking if the zebrafish Cxcl8s had the same biological role in the inflammatory response as in mammals. By using 3 days post-fertilization larvae and tail fin wound as an inflammatory stimulus we verified that both chemokines are induced after wounding and that both are crucial for normal neutrophil recruitment and inflammatory resolution. Additionally, using the open-source MATLAB package, PhagoSight, we found that Cxcl8s absence increase neutrophil recruitment speed. We postulated that this effect may be due to the existence of different neutrophil subpopulations with perhaps different functions that could respond differentially to CXCL8 chemokines and other chemoattractants expressed locally during inflammatory process thus exhibiting distinct migratory behaviors. In addition, we further addressed the role of Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 in the inflammatory response after infection. First, we found that both Cxcl8s are also induced upon different infectious stimuli. In the Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella Thyphimurium) infection model, we further observed that larvae survival, neutrophil recruitment and bacteria clearing are significantly reduced when compared to normal conditions. Altogether these results demonstrate that both Cxcl8 chemokines seem to be important for inflammatory response in zebrafish either against tissue damage or infection. Our findings fully establish the use of zebrafish as an ideal animal model to study Cxcl8 biological functions but most importantly we have expanded the knowledge concerning the chemokine function in vivo Besides being a modulator of early neutrophil recruitment, Duox1-derived H2O2 has been also shown to affect tissue regeneration what suggested to us that this molecule might also be involved in the modulation of the inflammatory response and could further be involved in inflammatory disorders. In this respect, our first goal was to address which signals would be able to activate Duox1 and further H2O2 production upon wounding. We demonstrated that, as an early danger signal released after wounding, ATP is able to activate purinergic P2Y receptors, and to further modulate Duox1 activity through phospholipase C (PLC) and intracellular calcium signaling. In addition, we also proved that the Duox1-derived H2O2 is able to trigger NF-B signaling pathway in the wound-associated inflammatory response. In view of the distinct temporal expression of these two chemotactic cues, we next hypothesized that H2O2 could be able to influence Cxcl8 signaling and by this way modulate later neutrophil recruitment and inflammatory response. Further studies led us to confirm that the early H2O2 signal is a key regulatory factor in the in vivo wound response by crosstalking with the later Cxcl8 signaling pathway. In particular, we showed that Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8-l2 expression by a complex mechanism involving SFKs, p38 and Jnk/AP1 signaling pathways, as well as histone 3 modifications and AP1 binding to cxcl8-l2 proximal promoter. Our findings support the idea that H2O2 is an early signal involved not only in initial neutrophil recruitment but is also essential for later neutrophil responses as well as other processes central to inflammation and tissue regeneration by modulating important signaling pathways like Cxcl8-l2, NF-κB and Jnk/AP1. Finally, we were also able to particularly present Duox1/H2O2 as a key modulator in skin inflammatory diseases. Here, we developed a skin inflammatory model, based on the perturbation of the role of the Tnfa/ Tnfr2 signaling in the maintenance of zebrafish skin homeostasis. In this, we observed that the blockade of this signaling pathway induces the production of H2O2 by Duox1 which in turn, activates NF-B and results in the upregulation of genes encoding pro-inflammatory mediators (such as Il1β and Cxcl8s) and neutrophil infiltration in skin tissues. Most importantly, we found that DUOX1 is induced in skin lesions of psoriasis and lichen planus patients, indicating the involvement of H2O2 and DUOX1 in human skin inflammation. Importantly, it is very likely that the H2O2-based mechanism here described is as well present in several other autoimmune/chronic inflammatory diseases. In this respect, pharmacologic and genetic therapies that target Duox1/H2O2 could provide innovative approaches to the management of not only psoriasis or lichen planus but also of other important inflammatory diseases. Altogether, the data reported in this thesis unraveled in our opinion important new findings in the field of inflammation not only regarding the Cxcl8 in vivo function in neutrophil recruitment and behavior, but also regarding H2O2 physiological function as an early inflammatory signal. Importantly, we clarified relevant issues involving Duox1 activation in vivo by showing the role of ATP and intracellular calcium in this matter. Additionally, we demonstrated the ability of H2O2 to modulate key inflammatory signaling pathways like NF-κB and Jnk/ AP1 and the existence of a crosstalk between early H2O2 and later Cxcl8-l2 signals. At the end we also were able to establish the involvement of H2O2 and DUOX1 in human and zebrafish skin inflammation. Overall this study has undoubtedly confirmed that the zebrafish is an ideal model to study the complex processes involved in neutrophil recruitment and in the inflammatory response.

Os neutrófilos são uma das principais células imunitárias de combate a agentes patogénicos que pertencem ao ramo inato do sistema imunitário. Estas células desempenham um papel importante na inflamação, devido a sua notável capacidade de ser rapidamente recrutadas para locais de infecção ou lesão e de reconhecer e fagocitar as ameaças, que em seguida mata através de uma combinação de mecanismos de citotoxicidade. Durante a ultima década, os neutrófilos demonstraram não ser simples células diferenciadas, com um tempo de vida curto e com uma função microbicida, mas também moduladores importantes da resposta imune adaptativa, agindo como células apresentadoras de antigénio, “ajudantes” de células B e supressores de células T. Alem disso, a ideia de que os neutrófilos são células “dead-end ", cujo destino final e a morte dentro dos tecidos inflamados, esta atualmente a perder poder devido a fortes evidencias in vivo da existência de um mechanismo de migração reversa de neutrófilos, tanto em peixes-zebra como em ratos. E importante salientar que os neutrófilos estão envolvidos em varias doenças inflamatórias autoimunes e cronicas, com taxas de incidência cada vez maiores na nossa sociedade. A este respeito, a desregulação dos mecanismos que controlam a resposta inflamatória em diversas doenças e frequentemente associada a infiltração de neutrófilos persistente no tecido e aos extensos danos provocados. Tendo em conta tudo isto e atualmente crucial expandir o nosso conhecimento sobre os mecanismos que regem a migração de neutrófilos, de modo a atingir de forma mais adequada componentes principais específicos e a avançar no desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para essas doenças. Nesta tese, focamos os nossos estudos em duas principais moléculas conhecidas como tendo um elevado poder quimiotático sobre os neutrófilos, o CXCL8 e o peroxido de hidrogénio (H2O2). CXCL8 e o membro prototípico da sub- família CXCL8/IL8-chemokine de quimiocinas CXC, que atua sobre os receptores CXCR1 e CXCR2. CXCL8 foi uma das primeira quimiocina a ser descoberta e devido ao seu papel biológico importante deu nome a esta sub- família. CXCL8 e conhecida principalmente por ser um quimioatrator potente para neutrófilos, embora também tenha sido demonstrado estar envolvida em outros processos, tais como na biologia e na função dos leucócitos, angiogenese e cancro. Quanto ao H2O2, foi ate recentemente extensivamente estudado como um dos componentes mais importantes da resposta oxidativa de neutrófilos. Em 2010, uma nova função foi descoberta para essa molécula na inflamação em peixe-zebra. Apos a sua produção por dual oxidase 1 (Duox1), o H2O2 demonstrou ser libertado pelo tecido lesado como um sinal responsável pelo recrutamento inicial de neutrófilos. Tendo em conta toda esta informação o nosso objetivo nesta tese foi abordar os mecanismos subjacentes a expressão/produção e função de CXCL8 e de H2O2 na inflamação do peixe-zebra e, mais importante entender se e como a ação destes sinais pode ser conciliada de modo a modular o recrutamento de neutrófilos durante a resposta inflamatória. O peixe-zebra e hoje em dia um modelo animal muito poderoso e promissor. Em particular, ele tem varias características que tornam este pequeno peixe num incrível, senão único, modelo para o estudo do recrutamento de neutrófilos através de métodos não-invasivos. As mais importantes são: genoma totalmente sequenciado; elevada homologia com os seres humanos; sistema imunológico que e notavelmente semelhante ao seu homologo em mamíferos (apos 4-5 semanas), permite o estudo da resposta imune inata independentemente da presença do sistema imune adaptado em estádios de desenvolvimento inicial; e talvez uma das mais interessantes características, a transparência dos seus embriões que, juntamente com a grande disponibilidade de linhas transgénicas permitem o rastreio in vivo de células especificas. Mais importante, o peixezebra tem dois verdadeiros homólogos da CXCL8 de mamíferos, nomeadamente Cxcl8-l1 e Cxcl8- l2, que estão ausentes do rato. A nossa primeira questão foi se Cxcl8s tinham a mesma função biológica na resposta inflamatória no peixe-zebra que nos mamíferos. Usando larvas de 3dias apos-fertilização e o corte de cauda como estimulo inflamatório verificou-se que ambas as quimiocinas sao induzidas apos o ferimento e que ambas são cruciais para o recrutamento normal de neutrófilos e resolução da inflamação. Alem disso, usando o pacote desenvolvido em código-aberto de MATLAB, PhagoSight, descobrimos que a velocidade de recrutamento dos neutrófilos aumenta na ausência de Cxcl8s. Proposemos então que este efeito se deve a existência de diferentes subpopulações de neutrófilos, talvez com diferentes funções, que poderão responder diferencialmente a quimiocinas CXCL8 e a outras moléculas quimioatrativas expressas localmente durante o processo inflamatório exibindo assim comportamentos migratórios distintos. De seguida estudamos a função de Cxcl8-l1 e Cxcl8-l2 na resposta inflamatória apos a infeção. Em primeiro lugar, verificamos que ambos os Cxcl8s são induzidos mediante diferentes estímulos infecciosos. Usando o modelo de infeção por Salmonella Typhimurium, observamos ainda que a taxa de sobrevivência, o recrutamento dos neutrófilos e a limpeza das bactérias são significativamente reduzidos uma vez comparados com as condições normais. Em conjunto estes resultados demonstram que ambas as quimiocinas CXCL8 parecem ser importante para a resposta inflamatória no peixe-zebra tanto provocados por danos no tecido como por infeção. As nossas descobertas estabelecem o uso do peixe-zebra como um modelo animal ideal para estudar as funções biológicas de CXCL8, mas a descoberta mais importante foi termos conseguido ampliar o conhecimento sobre a função de quimiocinas in vivo. Alem de ser um modulador inicial de recrutamento de neutrófilos, o H2O2 derivado de Duox1 também afecta a regeneração dos tecidos sugerindo que esta molécula pode estar envolvida na modulação da resposta inflamatória e ser importante em doenças inflamatórias. A este respeito, o primeiro objectivo foi descobrir que sinais libertados pela lesão seriam capazes de activar Duox1 e induzir a produção de H2O2. Demonstramos que o sinal de perigo, ATP , libertado logo apos lesão, e capaz de ativar os receptores purinérgicos P2Y, e de modular a atividade de Duox1 através da fosfolipase C (PLC) e sinalização intracelular de cálcio. Alem disso, também demonstramos que o H2O2 derivado de Duox1 e capaz de desencadear a activação da via de sinalização NF-κB. Em vista da expressão temporal distinto destes dois sinais quimiotáticos, postulamos a hipótese de que o H2O2 pode ser capaz de influenciar a sinalização CXCL8 e desta forma modular o recrutamento tardio de neutrófilos e da resposta inflamatória. Estudos posteriores levaram-nos a confirmar que o sinal inicial de H2O2 e um factor chave na regulação da resposta in vivo a lesão de tecidos através do “crosstalk” com a posterior via de sinalização de Cxcl8. Em particular, demonstramos que o H2O2 modula a expressão do Cxcl8-l2 por um mecanismo complexo que envolve SFKs , p38 e vias de sinalização Jnk/AP1 , bem como modificações da histona 3 e ligação de AP1 ao promotor proximal de Cxcl8- l2 . Os nossos resultados suportam a ideia de que o H2O2 e um sinal precoce envolvido não só no recrutamento inicial de neutrófilos, mas também essencial para a resposta de neutrófilos posterior, bem como para outros processos fundamentais na inflamacao e regeneracao dos tecidos, modulando vias de sinalização importantes como Cxcl8-l2, NF -kB e Jnk/AP1. Por fim, fomos capazes de apresente Duox1/H2O2 como um modulador chave em doenças inflamatórias da pele. Desenvolvemos um modelo inflamatório da pele, que tem por base a perturbação da função da sinalização de TNFa/TNFR2 na manutenção ao da homeostase da pele do peixe-zebra. Observamos que o bloqueio desta via de sinalização induz a produção de H2O2 por Duox1 e que por sua vez activa NF-κB, resultando na indução de genes que codificam mediadores pro-inflamatórios (tais como Il1β e Cxcl8s) e a infiltração de neutrófilos na pele. Mais importante, descobrimos que DUOX1 e induzida em lesões de pele de pacientes com psoriase e liquen plano, indicando o envolvimento de H2O2 e DUOX1 na inflamação da pele humana. E muito provável que o mecanismo baseado em H2O2 aqui descrito esteja presentes em varias outras doenças inflamatórias auto-imunes/cronicas. A este respeito, terapias farmacológicas e genéticas contra Duox1/H2O2 poderiam proporcionar abordagens inovadoras para a gestão não apenas de psoríase ou líquen plano, mas também de outras doenças inflamatórias importantes. Ao todo, os dados relatados nesta tese expõem na nossa opinião importantes novas descobertas no campo da inflamação, não só em relação a função de CXCL8 in vivo no recrutamento e comportamento dos neutrófilos, mas também em relação a função fisiológica do H2O2 como um sinal inflamatório inicial. Mais importante, esclarecemos questões relevantes que envolvem a ativação Duox1 in vivo, mostrando o papel do ATP e do cálcio intracelular nesta matéria. Alem disso, foi demonstrada a capacidade do H2O2 para modular principais vias de sinalização inflamatórias, como o NF -kB e Jnk / AP1 e a existência de um “crosstalk” entre H2O2 e Cxcl8-l2. No final, também fomos capazes de estabelecer o envolvimento de H2O2 e DUOX1 na inflamação da pele humana e de peixe-zebra. Em geral, este estudo confirmou que, sem dúvida, o peixe-zebra e um modelo ideal para estudar os processos complexos envolvidos no recrutamento dos neutrófilos e na resposta inflamatória.

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