Regulatory interactions between the metabolic sensors SIRT1 and AMPK in modulating PPARα linked functions, in obesity-dependent type 2 diabetes mellitus

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Funcionais), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Both genetic and environmental influences determine the risk of developing type 2 diabetes mellitus (T2DM). Epidemiological studies indicate that factors influencing the prevalence of T2DM include lifestyle (e.g. inactivity and dietary macronutrient composition), obesity and age. Interestingly maternal protein restriction (Maternal Low Protein; MLP) generates low birth weight (LBW) offspring, who develop insulin resistant and diabetic phenotype in later life. Interferon regulatory factors 3 and 4 (IRF3 and IRF4) are key repressors of adipogenesis. SIRT1, a histone/protein deacetylase, and AMP-activated protein kinase (AMPK) are key enzymes responsible for longevity and energy homeostasis. Through deacetylation and activation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1 α (PGC-1α), a transcriptional regulator of fatty acid (FA) oxidation, SIRT1 mediates activation of peroxisome-proliferator-activated receptor α (PPARα), which is a nuclear receptor that controls the expression of genes involved in glucose and lipid homoeostasis. The proposed study aims to investigate whether a positive feed back loop exists in response to AMPK/SIRT1 activation and try to characterize the role of this pathway in the regulatory circuit through which PPARα induces gene expression. C57Bl/6 mice fasted or fed a high fat diet (HF) and rat MLP-offspring were used to understand the importance of nutrient availability in the development of insulin-resistance and T2DM in liver and visceral white adipose tissue (WAT) respectively; specific liver and muscle AMPK α1/2 double null (AMPK-/-) mice were used to understand the role of AMPK on SIRT1 activation and PPARα linked functions; PPARα deficient mice were used to investigate the influence of PPARα deficiency on lipogenesis and β oxidation in mice visceral WAT; H4IIEC3 liver cell line was cultured and treated with a SIRT1 siRNA to better understand the feedback loop between SIRT1 and AMPK; L6 myoblasts were cultured and treated with AMPK agonist adiponectin and with insulin, and 3T3-L1 adipocytes were cultured and treated with PPARα agonists (WY14683) to understand the role of PPARα in IRF3 and IRF4. Using AMPK-/- liver and SIRT1 knockdown H4IIEC3 cells we found that, in the liver, AMPK and SIRT1 regulate each other to prevent lipid accumulation. Studies on HF fed mice, treated with nicotinamide mononucleotide (NMN), linked this 10 AMPK/SIRT1 pathway to phosphorylation of the insulin receptor substrate (IRS-1) at tyrosine residues, suggesting an involvement of the SIRT1/AMPK axis in the insulinsignalling pathway. In skeletal muscle AMPK deficiency impairs the beneficial effects of CR on glucose tolerance. This is linked to decreased SIRT1 gene expression, which could impair insulin signalling pathway, culminating in reduced glucose uptake. Using MLP-offspring visceral WAT, we found that suppression of interferon regulatory factors 3 and 4 (IRF3 and IRF4, respectively) represses fatty oxidation and enhances lipogenesis in MLP-offspring. IRF3 is possibly activated by AMPK, where IRF4 is activated by PPARα. Taken together, our results suggest that AMPK-SIRT1-PGC-1α-SIRT3 axis during fasting/CR is important to prevent metabolic disorders. Regulation of AMPK and PPARα linked functions together with deacetylation catalyzed by the sirtuins may prove to be important for the treatment of T2DM and other disorders associated with aging. Adiponectin (which activates AMPK and PPARα) and NMN (which increases SIRT1 activity) are potential therapeutic targets for the treatment of metabolic disorders.

A diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é uma doença metabólica de etiologia variada que continua a afectar pessoas em todo o mundo. Caracteriza-se essencialmente por alterações da ação da insulina e/ou da sua secreção, que resultam numa hiperglicémia crónica. O excesso de peso/obesidade e a inactividade física são as principais causas da T2DM em indivíduos geneticamente predispostos. A carência proteica durante a gravidez (restrição proteica na gravidez; MLP), resulta em recém-nascidos de baixo peso (LBW) que, numa fase mais tardia da vida desenvolvem insulinorresistência e um fenótipo de diabetes. A SIRT1 e a proteína cinase ativada-AMP (AMPK) constituem importantes enzimas responsáveis pela longevidade e pela homeostasia energética e, consequentemente, desempenham um papel importante no desenvolvimento de doenças metabólicas tais como a T2DM. Através de mecanismos de desacetilação, a SIRT1 regula a atividade do receptor nuclear - proliferador de peroxissoma α (PPARα) -, controlando assim a expressão de genes envolvidos no metabolismo da glucose e dos lípidos. Os factores que regulam o interferão 3 e 4 (IRF3 e IRF4), por serem repressores chave no processo de adipogénese, também merecem especial atenção no que respeita ao desenvolvimento de doenças metabólicas. O trabalho aqui proposto tem como objetivo investigar a potencial existência de um circuito positivo entre as proteínas AMPK e SIRT1 e tentar caracterizar o papel deste circuito, na indução da expressão genética regulada pelo PPARα. Ratinhos C57Bl/6 submetidos a jejum ou a uma dieta hiperlipídica (HF) e ratos MLP foram usados neste estudo. Os modelos descritos foram usados para avaliar o impacto da disponibilidade calórica e proteica no desenvolvimento de insulinorresistência e, consequentemente, da T2DM no fígado e tecido adiposo (WAT), respectivamente; ratinhos em que o gene AMPK α1/2 foi especificamente eliminado no fígado e músculo (AMPK-/-) foram usados para identificar o papel da ativação da AMPK e da SIRT1 nas funções ligadas ao PPARα; ratinhos PPARα knockout foram usados para investigar a deficiência de PPARα na lipogénese e betaoxidação do tecido adiposo visceral; células hepáticas H4IIEC3 cultivadas e tratadas com um SIRT1 siRNA, serviram para caracterizar o circuito positivo entre SIRT1 e AMPK; mioblastos L6 foram cultivados e tratados com um agonista da AMPK (adiponectina) e com insulina; adipócitos 3T3-L1 foram cultivados e tratados com um agonista do PPARα (WY14683) para identificar o papel do PPARα no IRF3 e no IRF4. Através da utilização de tecido hepático AMPK-/- e de células H4IIEC3 silenciadas para a SIRT1 verificou-se que, no fígado, a AMPK e SIRT1 regularam-se reciprocamente num processo que impede a acumulação de triacilgliceróis. O estudo de ratinhos alimentados com uma dieta HF, tratados com mononucleótido de nicotinamida (NMN), permitiu estabelecer uma ligação entre o circuito AMPK/SIRT1 e a fosforilação do substrato do receptor de insulina (IRS-1), sugerindo uma relação entre o circuito SIRT1/AMPK e a via da sinalização de insulina. No músculoesquelético, a deficiência da AMPK altera os efeitos benéficos da restrição calórica na tolerância à glucose, o que prova que este benefício é dependente da AMPK. A diminuição da expressão da SIRT1 aliada à deficiência da AMPK, altera a via da sinalização de insulina, o que resulta numa diminuição da entrada de glucose para as células. No tecido adiposo visceral, a inibição do IRF3 e do IRF4 reduz o processo de β-oxidação e aumenta o processo de lipogénese em ratos MLP. Os estudos realizados no tecido adiposo levaram à conclusão de que o IRF3 é potencialmente ativado pela AMPK, e o IRF4 é ativado pelo PPARα, num processo que envolve adiponectina. Os resultados obtidos sugerem que o eixo AMPK-SIRT1-PGC-1α-SIRT3 durante o jejum/CR é importante na prevenção de distúrbios metabólicos. Regular a atividade da AMPK e da sua interação com as sirtuinas na funções ligadas ao PPARα, pode ser potencialmente importante para o tratamento de distúrbios como a T2DM e outros associados ao envelhecimento. A adiponectina e o NMN são potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de doenças metabólicas.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)