Molecular and biotechnological approaches to essential oils production in thymus caespititius

Tese de doutoramento, Biologia (Biotecnologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

Thymus caespititius is an aromatic plant from the NW Iberian Peninsula and from the Azores and Madeira archipelagos. In this species chemical polymorphism in the essential oils has been described, with seven well defined chemotypes, namely thymol, carvacrol, α-terpineol, sabinene, and the mixed chemotypes thymol/sabinene, thymol/carvacrol and thymol/sabinene/carvacrol. T. caespititius essential oils already proved to have antimicrobial, antioxidant activity and acetylcholinesterase inhibition, and more recently they were shown to have high nematicidal activity against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus, namely the carvacrol and thymol rich oils. Since this species is not used commercially, the oils diversity observed results only from natural evolution; however, the molecular mechanisms underlying such chemical diversity are not yet clear. In this work were used molecular and biotechnological approaches to understand the basis for chemical diversity of T. caespititius’ essential oils. Five T. caespititius in vitro cultures from plants with different chemotypes were established, allowing having enough plant material for the following studies. This advantageous in vitro system avoids plant material collection from the natural habitat and the controlled growth conditions reduce the sources of variability known to affect essential oil composition. Terpenes are the main group components identified in T. caespititius essential oils. However the molecular basis of their synthesis has not yet been fully understood. Given this, the genes encoding enzymes of monoterpene biosynthesis were searched and identified in the five established in vitro genotypes and latter their expression level was assessed. It has been shown that biotic (pathogens, herbivores) and abiotic (temperature, light quality, nutrients type and availability) factors could influence the essential oil composition as well as the genes involved in their biosynthesis. So, nutrient composition and Botrytis cinerea fungal extracts were assayed in in vitro cultures to study the biosynthesis and accumulation of terpenes in this aromatic species. Collectively, it was demonstrated that the conditions established in this work also step up the possibility of using T. caespititius shoot cultures as an experimental model to investigate the terpene biosynthesis and accumulation in plants. The large biomass increase obtained in vitro advance the possibility of using large-scale in vitro production of desirable secondary metabolites. The terpene synthase genes identified and characterized here were a small contribution to understanding how these genes evolved, are regulated and function in Lamiaceae

Thymus caespititius é uma planta aromática nativa do NO da Península Ibérica e dos arquipélagos dos Açores e da Madeira. Nos óleos essenciais desta espécie foi encontrado polimorfismo químico, tendo sido definidos sete quimiotipos, nomeadamente timol, carvacrol, α-terpineol, sabineno, timol/sabineno, timol/carvacrol e timol/sabineno/carvacrol. Em estudos anteriores, os óleos essenciais de T. caespititius revelaram ter actividade antimicrobiana, antioxidante, anticolinesterásica e mais recentemente mostraram elevada actividade nematicida contra o nemátode da madeira do pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus), principalmente os óleos ricos em carvacrol e timol. Uma vez que esta espécie de tomilhos não está disponível comercialmente, a diversidade observada nos óleos visível mesmo em plantas cultivadas nas mesmas condições ambientais são resultado de evolução natural e não de selecção. Contudo os mecanismos moleculares envolvidos nesta diversidade química não são ainda claros. Neste trabalho, foram utilizadas abordagens moleculares e biotecnológicas de modo a compreender e esclarecer a diversidade química dos óleos essenciais de T. caespititius. A utilização de culturas in vitro em estudos de produção de óleos essenciais tem sido explorada em várias espécies aromáticas. A utilização deste sistema é vantajoso, pois não só evita a recolha de material vegetal do seu habitat natural, como também permite, pelas condições de crescimento controladas, reduzir as fontes de variabilidade que afectam a composição dos óleos essenciais. No presente trabalho de investigação, cinco genótipos foram estabelecidos in vitro, três com os quimiotipos carvacrol (C), carvacrol/timol (CT) e sabineno/carvacrol (SC) e dois resultantes de uma planta mãe com o quimiotipo α-terpineol (G1 e G2). Os óleos essenciais destes genótipos foram avaliados em culturas de rebentos em proliferação (6 a 24 repicagens após o estabelecimento in vitro) e comparados com os das respectivas plantas de campo. Os óleos essenciais foram isolados por hidrodestilação e analisados por GC e GC-MS. As culturas in vitro mantiveram estável a composição dos óleos essenciais durante os dois anos de análise. As culturas resultantes de gemas axilares (C, CT e SC) produziram óleo qualitativamente semelhante ao das plantas correspondentes em campo, apesar de pequenas diferenças quantitativas. O genótipo C revelou um perfil químico semelhante ao da planta de campo, sendo o carvacrol (20-69% nos rebentos e 71% na planta de campo) o componente maioritário dos óleos, seguido pelo acetato de carvacrilo (6-40% nas culturas in vitro e 4% na planta de campo). Para o genótipo CT, os componentes maioritários detectados na planta de campo foram o carvacrol (42%) e o timol (23%); enquanto nas culturas in vitro os componentes maioritários detectados foram o carvacrol (16-28%), o timol (17-25%), o acetato de carvacrilo (11-23%) e o acetato de timilo (9-15%). No genótipo SC, os componentes dominantes dos óleos essenciais tanto das plantas de campo como das culturas in vitro foram o carvacrol (11-28%), o sabineno (18-49%), e o timol (8-12%). As culturas in vitro resultantes de sementes (G1 e G2) apresentaram perfis de óleos essenciais diferentes dos da planta mãe (quimiotipo α-terpineol), esta diferença pode dever-se à variabilidade genética das sementes resultantes de cruzamentos abertos. Para G1 e G2 foi impossível determinar o seu quimiotipo. Nestes genótipos foram detectados baixos níveis de α-terpineol e o inverso foi observado para o timol, o carvacrol metil éter, o acetato de timilo e o carvacrol. O aumento de biomassa obtido com as culturas in vitro permitiu estudar a biossíntese dos terpenos e a sua regulação sob factores bióticos e abióticos. Os óleos essenciais de T. caespititius são uma mistura complexa de compostos, na sua grande maioria de natureza terpénica. No entanto, as bases moleculares da biossíntese destes compostos ainda não foram completamente esclarecidas. Posto isto, utilizaram-se as culturas in vitro de T. caespititius para procurar os genes envolvidos na biossíntese dos terpenos, nomeadamente os genes das terpeno sintase (TPS). Foram identificados e caracterizados três genes Tctps (Tctps2, Tctps4 e Tctps5) neste sistema; dois dos quais, Tctps2 e Tctps5, haviam já sido identificados em plantas de campo. O gene Tctps5 foi apenas detectado nos genótipos G1 e G2. Com o alinhamento dos três genes Tctps detectou-se que o Tctps4 não possuía péptido-sinal ou este era muito pequeno (3-4 aa) em comparação com Tctps2 e Tctps5 (46-47 aa). A grelha de leitura deste gene (1665 bp) é também menor que a dos genes Tctps2 (1794 bp) e Tctps5 (1806 bp). O alinhamento das sequências de aminoácidos das três terpeno sintases revelou que estas partilhavam 77% de semelhança. Tendo em conta a informação disponível das terpeno sintases de espécies da família Lamiaceae, o tamanho do gene Tctps4 sugeria que provavelmente este gene codificava uma sesquiterpeno sintase. Contudo, os ensaios enzimáticos das Tctps com o substrato GPP revelaram que tanto Tctps2 como Tctps4 codificavam para a γ-terpineno sintase, enquanto Tctps5 codificava para uma α-terpineol sintase. Estas proteínas não revelaram qualquer actividade sesquiterpénica em ensaios com FPP como substracto. Os ensaios enzimáticos com os extractos proteicos foram realizados a três temperaturas diferentes, 4º, 21º e 42ºC. Apesar destes dados serem apenas qualitativos, a temperatura não pareceu afectar a actividade da Tctps4, enquanto a 4ºC a actividade de Tctps2 isolada do genótipo C foi muito reduzida, sendo retomada com o aumento da temperatura. Nos restantes ensaios com Tctps2 não foram detectadas grandes diferenças de actividade. Quanto à Tctps5 pareceu existir uma variação no produto relacionada com a temperatura. Em baixas temperaturas o produto maioritário formado foi o limoneno, enquanto a 21ºC e 42ºC formou-se predominantemente o α-terpineol. A existência de dois isogenes para γ-terpineno sintase, sugere duplicação de genes durante o processo evolutivo, seguido de mutações levando à diferenciação dos dois genes, não comprometendo, no entanto, a actividade da proteína. É de salientar que nas plantas de T. caespititius analisadas, o gene Tctps4 encontrava-se menos expresso que o Tctps2. Nas plântulas in vitro foi detectada uma elevada acumulação de transcritos dos genes Tctps, ao contrário do verificado nas raízes. Este resultado era expectável, uma vez que, a síntese e acumulação dos terpenos em Lamiaceae ocorrem em células especializadas, como os tricomas glandulares existentes na parte aérea. A quantidade de γ-terpineno encontrada nos óleos essenciais de T. caespititius foi reduzida, o que poderá dever-se à sua rápida conversão em carvacrol e timol, dois dos componentes maioritários dos óleos desta espécie. Os estudos de mutagénese dirigida em Tctps2 demonstraram que o resíduo Arg-505 (R505G) é essencial para a estabilidade e/ou correcto enrolamento da proteína e a alteração desse aa por um aa hidrofóbico não-polar (Gly) quebrou essa estabilidade. A inserção de duas outras mutações neste gene (D405G e A521V) não revelou efeito na actividade da proteína. Ao longo dos anos, tem-se verificado que tanto os óleos essenciais como os genes envolvidos na sua biossíntese são influenciados por factores bióticos (agentes patogénicos, herbívoros) e abióticos (temperatura, qualidade da luz, tipo e disponibilidade de nutrientes). Por este motivo foram feitos ensaios nas culturas in vitro de T. caespititius para avaliar o efeito de diversos factores na biossíntese e acumulação dos terpenos. Os cinco genótipos estabelecidos in vitro foram colocados a crescer em dois meios de cultura, MS e SH, de forma a testar o efeito da composição de nutrientes. Nas culturas crescidas em SH observou-se maior rendimento de óleo (0.3-3.4%) do que nas culturas crescidas em MS (0.3-1.2%). Os óleos essenciais das plantas crescidas nas duas condições foram qualitativamente semelhantes. Contudo, observaram-se algumas diferenças quantitativas, principalmente nos compostos com o grupo acetato, acetato de timilo e acetato de carvacrilo, cuja quantidade relativa diminuiu nos rebentos crescidos em SH. Os componentes maioritários dos óleos isolados do genótipo C foram o carvacrol (25-60%) e o acetate de carvacrilo (9-45%). As plantas crescidas em SH continham menos acetato de carvacrilo (9-13%) do que as plantas desenvolvidas em MS (23-45%). Quanto aos óleos do genótipo CT, detectou-se elevada percentagem de carvarol (13-28%), timol (14-23%), acetato de carvacrilo (10-26%) e acetato de timilo (8-18%). Nestes óleos também se observou uma diminuição da quantidade relativa nos compostos com o grupo acetato. Nas culturas SC, os componentes maioritários dos óleos foram o sabineno (35-45%), o carvacrol (11-19%) e o timol (8-11%). Já nos óleos essenciais dos genótipos G1 e G2, os componentes identificados em maior concentração foram o p-cimeno (7-34%), o γ-terpineno (4-21%), o timol (4-18%) e o carvacrol metil éter (4-17%). Nas plantas crescidas em SH observou-se uma diminuição na quantidade relativa de carvacrol metil éter (4-8%), sendo o inverso observado no p-cimeno (10-34%) e no γ-terpineno (6-21%). Em G2, também se observou diminuição na quantidade de timol (4-7%). A acumulação dos transcritos das terpeno sintase (Tctps2 e Tctps4) foi superior nas culturas in vitro desenvolvidas em SH, excepto no genótipo SC. Em G1 e G2, o gene Tctps4 apresentou-se menos expresso que nos restantes genótipos. Quanto ao gene Tctps5 a sua expressão foi apenas detectada em G1 e G2; culturas onde se observou maior quantidade de α-terpineol. Entre os dois meios de cultura testados observam-se várias diferenças na sua composição nutricional, sendo a concentração de azoto e a razão NH4 +/NO3- as mais notórias. Estes poderão estar relacionados com as diferenças observadas na composição dos óleos essenciais e na expressão dos genes das terpeno sintase. No entanto, será necessário confirmar esta hipótese, testando diferentes concentrações de azoto e razões NH4 +/NO3- em MS. Os extractos fúngicos de Botrytis cinerea não afectaram qualitativamente nem quantitativamente os óleos de CT, no entanto em SC, observou-se diminuição do conteúdo de sabineno e aumento dos compostos com actividade antifúngica, carvacrol e timol. A expressão dos genes Tctps2 e Tctps4, avaliada ao longo de 30 dias não revelou diferenças entre controlo e stress (presença de extracto de B. cinerea). No genótipo SC, os extractos fúngicos aumentaram cerca de 6x a expressão dos genes Tctps nas primeiras horas de tratamento. Enquanto em CT apenas se observou um ligeiro aumento (aproximadamente 2.8x). Nos restantes pontos de análise observou-se diminuição da regulação destes genes (cerca de 1.5-15.7x nas culturas CT e 1.0-3.5x nas culturas SC), o que pode estar relacionado com a translocação dos recursos energéticos para actividades vitais da planta. Neste trabalho foi possível demonstrar que as culturas in vitro de T. caespititius são um bom modelo experimental para a investigação da biossíntese e acumulação de terpenos. A identificação e caracterização dos genes das terpeno sintase neste trabalho permitem contribuir para a compreensão da função, regulação e evolução destes na família Lamiaceae.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)