Deciphering the molecular role of DJ-1 in the etiology of Parkinson’s and Huntingtons’s disease

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Neurodegenerative diseases are among the most complex and puzzling human disorders. These devastating disorders currently do not have any effective therapies or treatments, and thus are a social and economic burden for modern society. Intense efforts are being made to unravel the mechanisms underlying this group of diseases, however there is still much to be learnt and discovered. Therefore, it is of utmost importance to better understand the biological mechanisms involved in disease pathogenesis, and more importantly, to discover novel avenues for therapeutic intervention. Budding yeast have been successfully used to perform studies on these diseases that have resulted in the identification of several promising therapeutic drugs and targets. The ease of experimental manipulation, the high conservation in basic cellular mechanisms between yeast and humans, and the well defined genome are three of the numerous characteristics that make yeast so attractive to researchers studying neurodegenerative disorders. Here, we used the budding yeast to study the molecular basis of two neurodegenerative diseases: Huntington’s (HD) and Parkinson’s disease (PD). HD is a fatal neurodegenerative disorder caused by a well defined genetic cause, which is an expansion of a polyglutamine tract in the huntingtin (Htt) protein. We have used a yeast HD model to find differentially expressed genes (DEGs) in wild-type yeast in response to mutant Htt toxicity, as well as in three Htt toxicity suppressor strains: bna4Δ, mbf1Δ, and ume1Δ. We found common DEGs in the suppressor strains involved in stress response, translation elongation, and mitochondrial transport. We then tested whether overexpression of the DEGs suppress mutant Htt toxicity. We identified 12 novel suppressors, including genes that play a role in stress response and rRNA processing. We have integrated the microarray and the genetic screening data that allowed us to generate a robust network that showed enrichment in genes involved in rRNA processing and ribosome biogenesis. Altogether, our results suggest that dysfunctional translation is implicated in HD. Ultimately pharmacological manipulation of translation may have therapeutic value in HD. PD is the most common progressive neurodegenerative movement disorder. One of the proteins that when mutated leads to autosomal recessive forms of PD is DJ-1. The precise function of this protein and how this protein leads to PD is unclear. Yeast has four proteins that belong to the conserved DJ-1 superfamily: Hsp31, Hsp32, Hsp33 and Hsp34. Very little is known about their function. Here, we show that the yeast DJ-1 vi homologs are required for diauxic-shift, an important metabolic reprogramming stage in yeast that is triggered by glucose limitation. We found that the Hsp31 genes are strongly induced in diauxic-shift and in stationary phase, and that deletion of these genes leads to reduced chronological lifespan, an inability to reprogram gene transcription at diauxic-shift, and failure to acquire several typical characteristics of stationary phase, including defective autophagy induction. Furthermore, we showed that these proteins contribute to TORC1 regulation, a central signaling pathway involved in diauxic-shift reprogramming and, importantly, in autophagy. As dysregulation of both autophagy and TORC1 are associated with several disorders – including PD – our work may have broad relevance to understanding these processes in health and disease. These novel insights into the function of the yeast DJ-1 homologs contribute to the understanding of the normal function of both human DJ-1 and the remaining DJ-1 superfamily members, and may therefore bear therapeutic implications in various human diseases. The human DJ-1 is thought to act as a redox-dependent chaperone by preventing the aggregation of misfolded proteins in oxidative stress conditions. One of the potential targets of DJ-1 is α-synuclein, which is the major component of Lewy bodies in PD. Oxidative stress is linked to several neurodegenerative diseases including HD. Here, we show that DJ-1 plays a potential role in the pathogenesis of HD, by modulating Htt aggregation and toxicity likely, by acting as a redox-dependent chaperone. We found that DJ-1 is upregulated and abnormally oxidized in the brains of HD patients, which is how DJ-1 is found in brains of patients with PD and Alzheimer’s disease. Our results suggest a general role for DJ-1 as a redox-dependent chaperone that may have an impact in the pathogenesis of several protein misfolding diseases. Furthermore, it establishes DJ-1 as a potential therapeutic target for HD. Overall, the work presented in this thesis opens novel avenues of research and therapeutics for HD and PD and proposes that DJ-1 has broad relevance in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.

As doenças neurodegenerativas estão entre as doenças humanas mais complexas e enigmáticas. As terapias e tratamentos actualmente existentes não são eficazes, causando um impacto negativo na sociedade moderna, tanto a nível social como económico. Apesar do esforço empregue na compreensão dos mecanismos patogénicos associados a este grupo de doenças, ainda há muito por explorar e aprender. É urgente investigar os mecanismos moleculares que levam a essas patologias e descobrir novos alvos terapêuticos. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido usada com sucesso no estudo de doenças neurodegenerativas e já resultou na identificação de vários alvos terapêuticos bem como de compostos com potencial terapêutico bastante promissor. As leveduras, como modelo biológico, apresentam várias vantagens que as tornam atractivas para estudar estas doenças, incluindo a sua fácil manipulação laboratorial, a conservação dos mecanismos celulares básicos até aos humanos, e extensa caracterização do seu genoma. Nesta tese, as leveduras foram o modelo escolhido para estudar os mecanismos moleculares associados a duas doenças neurodegenerativas: a doença de Huntington (DH) e a doença de Parkinson (DP). A DH é uma doença neurodegenerativa fatal, geneticamente bem caracterizada, causada por uma mutação genética no gene IT15, que consiste na repetição anormal da sequência de nucleotídeos CAG, originando a expansão de uma região rica em glutaminas na proteína huntingtina (Htt). O modelo de levedura para a DH foi usado para detectar genes diferencialmente expressos (GDE) em células a expressar a proteína Htt mutada, assim como em três estirpes supressoras de toxicidade de Htt: bna4Δ, mbf1Δ, e ume1Δ. Nestas estirpes supressoras da toxicidade foram encontrados GDE envolvidos na resposta ao stress, no alongamento durante a tradução do mRNA e no transporte mitocondrial. A sobre-expressão dos GDEs levou à identificação de 12 novos genes supressores da toxicidade provocada pela Htt, incluindo genes envolvidos na resposta ao stress e no processamento do rRNA. Pela integração dos resultados provenientes de microarrays e do screening genético, através de ferramentas informáticas, construiu-se uma rede de interacções que mostra um enriquecimento de genes envolvidos no processamento do rRNA e na biogénese de ribossomas associado à toxicidade da Htt. Estes resultados sugerem que a desregulação do processo de tradução está associado à DH e que novas terapias podem surgir pela modulação farmacológica deste processo. A DP é a doença neurodenegerativa motora progressiva mais comum. Um dos genes geneticamente associados à DP, transmitida de uma forma autossómica recessiva, codifica a proteína DJ-1. A função normal desta proteína é ainda pouco clara e não se conhece ainda o papel da mutação desta proteína no desenvolvimento da DP. As leveduras têm quatro proteínas que pertencem à conservada superfamília da DJ-1: Hsp31, Hsp32, Hsp33 e a Hsp34, no entanto pouco se conhece sobre a sua função. Nesta tese, mostra-se que os homólogos da DJ-1 são necessários para a transição do metabolismo fermentativo para o respiratório, uma importante reprogramação metabólica nas leveduras originada pela falta de glucose. A deleção dos genes HSP31-34 leva a um envelhecimento mais rápido de leveduras em fase estacionária e à ausência de várias características desta fase, que incluem a ausência de indução do processo autofágico. Em particular, mostramos que estas proteínas contribuem para a regulação da TORC1, uma via de sinalização envolvida nesta reprogramação, e mais importante ainda, na autofagia. Tendo em conta, que tanto a desregulação da TORC1 como da autofagia estão associadas a várias doenças, incluindo a DP, este trabalho pode ser relevante para a compreensão destes processos não só em condições normais, como também patológicas. Estas novas descobertas associadas à função dos homólogos em leveduras da DJ-1 contribuem para a compreensão da função da proteína humana e dos outros membros da superfamília DJ-1, podendo trazer implicações terapêuticas em várias doenças humanas. Uma das funções propostas para a DJ-1 humana é a de actuar como uma chaperone dependente do estado redox, que previne a agregação de proteínas sem conformação definida em condições de stress oxidativo. Um dos potenciais alvos da DJ-1 é a α-sinucleína, o componente mais importante dos corpos de Lewy, na DP. O stress oxidativo é um mecanismo molecular associado a diversas doenças neurodegenerativas, incluindo a DH. Neste estudo, demonstramos que a DJ-1 poderá ter um papel importante na patogénese da DH, pois consegue modular a agregação e toxicidade da Htt, possivelmente através da sua função como chaperone. Neste trabalho demonstramos que a DJ-1 está mais expressa e anormalmente oxidada em cérebros de doentes com DH, à semelhança do que acontece nos doentes com DP e doença de Alzheimer. Os nossos resultados sugerem que a DJ-1 apresenta um papel geral como chaperone, dependente do estado redox, e cujo impacto na patogénese de diversas doenças relacionadas com a agregação de proteínas não deve ser desvalorizado. Para além disso, determina a DJ-1 como um potencial alvo terapêutico para a DH. O trabalho apresentado nesta tese abre novos campos de investigação e estratégias terapêuticas, sugerindo que a proteína DJ-1 está associada à patogénese de várias doenças neurodegenerativas como a DP e DH.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)