Lancefield group C and G streptococci in human infection : molecular typing, virulence and antimicrobial susceptibility

Tese de doutoramento, Ciências e Tecnologias da Saúde (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Beta-hemolytic, large-colony-forming (diameter greater than 0.5 mm) Lancefield group C and group G streptococci (GCGS) is a group within the Streptococcus genus which includes several species recognized as either colonizers or pathogens in humans and animals. Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (SDE), which can express any of these two Lancefield group antigens, is the GCGS species most commonly reported in human infection worldwide and may cause a number of potentially life-threatening infections. SDE is increasingly regarded as an emerging global pathogen and is able to colonize and infect humans, while other GCGS species, such as Streptococcus canis, are mainly animal pathogens that occasionally infect the human host. The rising number of human infections reported to be caused by GCGS warrants a better study of their epidemiology, in order to establish the relevance of each species, and clarifying the clonal dynamics and the intra-specific factors influencing the virulence of the strains. This work aimed at determining the GCGS species responsible for human infection in Portugal and, by assessing the genetic diversity of the isolates recovered, to define the clonal structure of this population. Thus, a special emphasis on molecular typing techniques was given, including those more commonly used to type these streptococci: pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), emm typing and multilocus sequence typing (MLST). The application of these techniques to characterize collections of SDE and S. canis isolates recovered from other geographic locations and, for the latter species, from animal hosts, allowed to elucidate their respective population structures and provided new insights into the biology and evolution of GCGS. Initially, the speciation and characterization of GCGS isolates recovered from human infections in Portugal identified the central role of SDE. Not only was there a weak correlation between emm typing and PFGE results, but the polyclonal origin of the SDE population in this region was revealed by each of the methods used that generated multiple partitions. Furthermore, a correlation between emm type and invasive disease potential was suggested. A more global snapshot of the clonal architecture of this pathogen population was achieved by developing a MLST scheme which was applied to an expanded collection of SDE isolates recovered from distinct continents. An association of Lancefield groups with distinct MLST partitions was found and the high prevalence of a small number of widely distributed MLST sequence types (STs) suggested that a few genetic lineages dominate among SDE causing human infection worldwide. The occurrence of intra-specific and inter-specific recombination with Streptococcus pyogenes (Lancefield group A streptococcus, [GAS]), involving the housekeeping genes used in MLST was detected. The poor correlation between emm typing and either PFGE or MLST defined groups was illustrated by lineages displaying distinct emm types and the presence of the same emm type in unrelated genetic backgrounds, as defined by both techniques. These observations suggested the existence of recombinational replacements involving the emm locus and question the value of emm typing to accurately ascertain the genetic relatedness of SDE strains. The characterization of the antimicrobial susceptibility patterns presented by SDE found a high proportion of levofloxacin-resistant isolates (12%) associated with multiple genetic lineages. Sequence analysis of the quinolone resistance-determining regions of the gyrA and parC genes of representative resistant and susceptible isolates showed that full resistance was associated with mutations in both GyrA and ParC. As observed for the housekeeping genes used in MLST, recombination with GAS DNA in some parC alleles was evident, though this phenomenon was not exclusively associated with resistance. The final part of the work in this thesis focused on S. canis, the second most frequent GCGS species isolated from human infections in Portugal. A collection of S. canis isolates recovered from infections in both humans and animals, collected in Portugal and abroad, were characterized by employing the same typing methods used for SDE. The S. canis population was polyclonal, and several genetic lineages were shown to possess the ability to infect the human host. The zoonotic nature of S. canis infection was demonstrated, as identical genetic lineages were found infecting house pets and humans, indicating that they constitute a single population. Phylogenetic analysis showed that S. canis was a divergent taxon of SDE and GAS and unveiled the acquisition of genetic material of SDE by S. canis. The presence of emm-like genes was restricted to a few S. canis isolates and correlated with some MLST-based genetic lineages. Globally, this thesis contributes to the current knowledge of the molecular epidemiology and evolutionary relationships among members of the two GCGS species studied. The clonal relationships among strains were elucidated and MLST schemes for SDE and S. canis were established, providing useful tools for future studies of their population dynamics. The use of emm typing was shown to be complemented by applying other typing methods and the role of the M protein in SDE virulence was reinforced. The evidence found for recombinational replacements between SDE and GAS in several loci and, to a smaller extent, between SDE and S. canis, indicates that horizontal gene transfer events are important mechanisms driving genetic variability in GCGS populations which may impact key bacterial functions such as virulence and antimicrobial resistance.

Os estreptococos beta-hemolíticos formadores de colónias grandes (diâmetro superior a 0.5 mm) dos grupos C e G de Lancefield (GCGS) formam um grupo dentro do género Streptococcus que inclui várias espécies reconhecidas como colonizadoras ou agentes patogénicos no Homem e em animais. Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (SDE), que pode integrar cada um destes dois grupos de Lancefield, é a espécie de GCGS mais vezes reportada em infecção humana a nível mundial e pode causar diversas infecções potencialmente fatais. SDE é cada vez mais visto como um agente patogénico emergente, com a capacidade de colonizar e infectar o Homem, enquanto as outras espécies de GCGS, tais como Streptococcus canis, são principalmente agentes patogénicos de animais que ocasionalmente infectam o hospedeiro humano. O número crescente de infecções humanas atribuídas aos GCGS exige um estudo reforçado da sua epidemiologia, de modo a estabelecer a relevância de cada espécie e permitindo que a dinâmica clonal e os factores intra-específicos que influenciam a virulência das estirpes sejam clarificados. Este trabalho teve como objectivo identificar as espécies de GCGS responsáveis por infecção humana em Portugal e, através da avaliação da diversidade genética das estirpes recolhidas, definir a estrutura clonal da população. Deste modo, foi dado especial ênfase às técnicas de tipagem molecular, incluindo aquelas que mais habitualmente são utilizadas para a tipagem destes estreptococos: a electroforese em campo pulsado (PFGE), a tipagem emm e “multilocus sequence typing” (MLST). A aplicação destas técnicas para caracterizar colecções de estirpes de SDE e S. canis isoladas noutras regiões geográficas e, no caso da última espécie, de hospedeiros animais, permitiu elucidar as respectivas estruturas populacionais e percepcionar novos aspectos da biologia e evolução dos GCGS. Inicialmente, a especiação e caracterização de estirpes de GCGS isoladas de infecções humanas em Portugal mostrou o papel central de SDE. Verificou-se uma fraca correlação entre os resultados obtidos pela tipagem emm e PFGE e a aplicação destas técnicas revelou a origem policlonal da população de SDE nesta região, dado que cada um dos métodos utilizados gerou múltiplas divisões. Adicionalmente, os resultados sugeriram a existência de uma correlação entre o tipo emm e o potencial de doença invasiva. Uma imagem mais geral da estrutura apresentada pela população deste agente patogénico foi alcançada através do desenvolvimento de um esquema de MLST, aplicado a um conjunto alargado de estirpes de SDE isoladas em continentes distintos. Esta análise permitiu estabelecer uma associação entre grupos de Lancefield e divisões distintas de MLST. Foi possível observar uma elevada prevalência de um pequeno número de “sequence types” (STs) na população. A ampla distribuição geográfica destes STs sugeriu o predomínio de algumas linhagens genéticas entre as estirpes de SDE que causam infecção humana em todo o mundo. Foi detectada ainda a ocorrência de recombinação intra-específica e inter-específica com Streptococcus pyogenes (estreptococos do grupo A de Lancefield, [GAS]), envolvendo genes “housekeeping” utilizados no MLST. A fraca correlação entre tipos emm e os grupos definidos por PFGE ou por MLST foi ilustrada pela existência de linhagens com tipos emm distintos e pela presença do mesmo tipo emm em patrimónios genéticos não relacionados, tal como definido pelas duas técnicas de tipagem. Estas observações sugeriram a existência de substituições recombinacionais envolvendo este locus e questionam o valor da tipagem emm para determinar correctamente a relação genética de estirpes de SDE. A caracterização dos perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos apresentados por SDE permitiu detectar uma elevada percentagem de estirpes resistentes à levofloxacina (12%), associada a múltiplas linhagens genéticas. A análise das sequências das regiões determinantes da resistência às quinolonas nos genes gyrA e parC de estirpes resistentes e susceptíveis representativas, mostrou que a aquisição de resistência se encontra associada a alterações dos aminoácidos das proteínas codificadas pelos dois genes. A existência de recombinação com ADN de GAS foi evidente em alguns alelos do gene parC, como observado para os genes “housekeeping” utilizados no MLST. No entanto, este acontecimento não foi associado exclusivamente com o desenvolvimento de resistência. A parte final do trabalho descrito nesta tese focou-se na segunda espécie de GCGS mais frequentemente isolada de infecções humanas em Portugal, S. canis. Uma colecção constituída por estirpes de S. canis isoladas de infecções em seres humanos e animais, recolhidas em Portugal e no estrangeiro, foi caracterizada recorrendo aos mesmos métodos de tipagem utilizados para SDE. A policlonalidade da população de S. canis foi evidenciada e várias linhagens genéticas mostraram ter a capacidade de infectar o hospedeiro humano. A natureza zoonótica da infecção por S. canis foi demonstrada pois as mesmas linhagens genéticas foram encontradas a infectar animais domésticos e seres humanos, indicando a existência de uma única população. A análise filogenética mostrou que S. canis é um taxon divergente das espécies SDE e GAS e revelou a aquisição de material genético de SDE por S. canis. A presença de genes similares ao gene emm restringiu-se a uma pequena proporção das estirpes de S. canis e correlacionou-se com algumas das linhagens genéticas definidas por MLST. Globalmente, este trabalho contribuiu para o conhecimento actual da epidemiologia molecular e das relações evolutivas entre os membros das duas espécies de GCGS estudadas. As relações clonais entre as estirpes foram elucidadas e esquemas de MLST foram estabelecidos para SDE e S. canis, constituindo ferramentas úteis para futuros estudos sobre a dinâmica populacional destas espécies. Mostrou-se que a utilização da tipagem emm é complementada pela aplicação de outros métodos de tipagem e a importância da proteína M na virulência de SDE foi reforçada. As indicações encontradas da ocorrência de trocas recombinacionais entre SDE e GAS em vários loci e, em menor extensão, entre SDE e S. canis, indica que os eventos de transferência genética horizontal são mecanismos motrizes da variabilidade genética em populações de GCGS, podendo afectar aspectos fulcrais da biologia destas espécies, como a virulência e a resistência aos antimicrobianos.

Fundação Calouste Gulbenkian