Using genomics for drug discovery in medulloblastoma

Tese de doutoramento, Medicina (Neurocirurgia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in childhood. The standard of care to treat patients with medulloblastoma includes surgical resection, craniospinal irradiaton (in children older than 3 years of age) and high dose chemotherapy. Overall survival rates for patients submitted to conventional treatment protocols have reached 70-80% but the majority of survivors suffer from severe long-term side effects, including developmental, cognitive, neurological and neuroendocrine deficits. For many years medulloblastoma was considered a single entity, a small, round bluecell tumor on histology, originating in the cerebellum. Recently, integrative genomic studies have identified at least four distinct molecular subgroups – WNT, sonic hedgehog (SHH), Group 3 and Group 4 – which display disparate transcriptional profiles, genetic abnormalities, patient demographics and clinical outcome. Patients with WNT medulloblastomas have a very good outcome. Patients with SHH and Group 4 tumors have an intermediate prognosis. Group 3 medulloblastomas are characterized by frequent amplifications or aberrant expression of the oncogene MYC, a high percentage of metastasis at diagnosis and a very poor prognosis despite aggressive therapy. Although disseminated disease at diagnosis is a known factor of poor survival, the mechanisms of dissemination are not fully understood and metastatic lesions are highly genetically divergent from their matched primary tumor. Therefore, we asked whether we could use genomics to discover novel and less toxic small molecule inhibitors to target medulloblastoma in a subgroup-specific manner. To answer our research question we used two approaches: 1) targeting the hepatocyte growth factor (HGF)/cMET pathway, known to be important in medulloblastoma pathogenesis, with the cMET inhibitor, foretinib and 2) performing a gene expression-based in silico drug screen to identify small molecule inhibitors with selective antitumor effect in Group 3 medulloblastomas. Aberrant signaling through the (HGF)/cMET pathway is involved in tumor progression and metastasis in several human cancers. cMET is a transmembrane receptor which becomes activated through phosphorylation of tyrosine residues upon binding of its ligand HGF. The recruiment of cytoplasmic effector proteins upon cMET activation triggers multiple downstream effector pathways including mitogen activated protein kinase (MAPK) and phosphoinositide 3-kinase (PI3K). In medulloblastoma, cMET activation has been associated with tumor growth and invasion. To determine the subgroup-specific role of cMET in medulloblastoma, we analyzed the mRNA expression of three large non-overlapping cohorts of patients with primary medulloblastomas (discovery cohort from Boston, n = 199; validation cohort 1, a multicentre cohort obtained from Heidelberg, n = 439; validation cohort 2, a multicentre cohort obtained from the Medulloblastoma Advanced Genomics International Consortium - MAGIC, n = 285) and demonstrated that cMET is a marker of SHH medulloblastoma. Immunohistochemical analysis of activated cMET (phosphorylated cMET) in another independent patient cohort (n = 385) validated these findings and revealed that cMET activation correlates with increased tumor relapse and a poor survival in pediatric patients with SHH medulloblastomas, thus defining a subset of patients that may benefit from cMET targeted therapy. We selected foretinib, an FDA approved multikinase inhibitor with high affinity to the cMET receptor, to evaluate the effect of cMET targeting in SHH medulloblastoma. Foretinib suppressed cMET activation, decreased proliferation and induced apoptosis, both in medulloblastoma cell lines and in SHH medulloblastoma flank xenografts. Importantly, we characterized the pharmacokinetics of foretinib and demonstrated that it penetrates the bloodbrain barrier and is well tolerated through intrathecal administration. Treatment of mouse intracranial xenografts and of an aggressive transgenic mouse model of metastatic SHH medulloblastoma (Patched+/- mouse with the Sleeping Beauty transposon system) with foretinib reduced primary medulloblastoma growth and invasion, decreased the incidence of metastases by 36% and increased survival by 45%. To investigate potential novel small molecules to target Group 3 medulloblastomas we used a bioinformatic platform called the Connectivity Map (C-MAP). The C-MAP contains a collection of gene expression profiles from several human cell lines treated with a large number of compounds already FDA approved. Comparative analysis between the oncogenic gene signature of interest and the C-MAP database may highlight patterns of gene expression change and identify small molecules with potential predicted activity within a given cancer. We queried the C-MAP using the subgroup-specific gene expression signatures of the four medulloblastoma subgroups. Piperlongumine, a natural product extracted from the fruit of the Piper longum, was the top candidate drug for non-WNT tumors. We then selected compounds predicted to have specific antitumor activity for Group 3 medulloblastomas and the cyclindependent kinase (CDK) inhibitor alsterpaullone ranked number one. To validate our findings we used two established Group 3 medulloblastoma cell lines (D425 and D458) and a medulloblastoma stem cell line derived from a patient with a Group 3 tumor (M441). The C MAP predicted drugs were able to decrease cell proliferation in vitro and to reduce tumor growth and increase survival in Group 3 medulloblastoma mouse xenografts. Alsterpaullone showed the highest efficacy both in vitro and in vivo in the patient derived medulloblastoma stem cell line. Interestingly, the chemical genomic profiling of Group 3 medulloblastoma cells treated with alsterpaullone confirmed inhibition of cell cycle-related genes and showed down-regulation of MYC, the hallmark oncogene of Group 3 tumors. We used a gene expression-based approach to identify molecular targeted therapy to treat medulloblastoma. Our results demonstrate the preclinical efficacy of two small molecule inhibitors: foretinib in metastatic SHH medulloblastomas and alterpaullone in Group 3 tumors. Given the dismal outcome and lack of options for these patients, the results from our studies provide strong rationale for advancing both compounds as targeted agents into clinical trials for patients with these highly aggressive subgroups of medulloblastoma.

O meduloblastoma é o tumor cerebral maligno mais comum na população pediátrica. O tratamento convencional dos doentes com meduloblastoma inclui resseção cirúrgica máxima, radioterapia do crânio e do neuroeixo (em crianças com idade superior a 3 anos) e quimioterapia de alta dose. A sobrevida global em doentes submetidos a protocolos de tratamento convencional atinge os 70-80% mas a maioria dos sobreviventes apresenta sequelas graves dos tratamentos incluindo problemas no desenvolvimento, defeitos cognitivos, neurológicos e neuroendócrinos. Durante muito anos o meduloblastoma foi considerado uma entidade única, um tumor de pequenas células azuis na observação histológica, oriundo do cerebelo. Recentemente, estudos de genómica integrada identificaram pelo menos quatro subgrupos moleculares de meduloblastoma – WNT, sonic hedgehog (SHH), Grupo 3 e Grupo 4 – que apresentam características distintas no que diz respeito ao perfil transcriptómico, anomalias genéticas, dados demográficos e sobrevida. Doentes com meduloblastomas do tipo WNT têm muito bom prognóstico. Doentes com tumores do tipo SHH e Grupo 4 têm um prognóstico intermédio. Os meduloblastomas do Grupo 3 são caracterizados por amplificações frequentes ou expressão aberrante do oncogene MYC, uma elevada incidência de metástases na altura do diagnóstico e um mau prognóstico apesar de terapias agressivas. Embora a presença de doença disseminada na altura do diagnóstico seja um factor conhecido de baixa sobrevida, os mecanismos de disseminação são pouco conhecidos e as lesões metastáticas são geneticamente divergentes do seu tumor primário. Assim, questionámos se seria possível usar a genómica na descoberta de pequenas moléculas inibidoras dirigidas aos subgrupos moleculares de meduloblastoma. Para responder à nossa pergunta utilizámos duas abordagens: 1) uma terapia dirigida à via de sinalização do factor de crescimento dos hepatócitos (HGF)/cMET, conhecida pelo seu importante papel na patogénese do meduloblastoma, usando um inibidor do receptor cMET, foretinib e 2) um rastreio farmacológico in silico com base na expressão genética para identificar pequenas moléculas inibidoras com efeito antitumoral selectivo nos meduloblastomas do Grupo 3. A sinalização aberrante através da via de transdução de sinal (HGF)/cMET está envolvida na progressão tumoral e metastização de vários cancros humanos. cMET é um receptor transmembranar que é activado através da fosforilação de resíduos de tirosina, após interacção com o seu ligando HGF. O recrutamento de proteinas efectoras citoplasmáticas após a activação de cMET desencadeia a activação de múltiplas vias de sinalização incluindo MAPK (mitogen activated protein kinase) e PI3K (phosphoinositide 3-kinase). No meduloblastoma a activação de cMET tem sido associada a crescimento e invasão tumoral. Para determinar a importância de cMET nos diferentes subgrupos de meduloblastoma, analizámos a expressão de mRNA em três grupos independentes de doentes com meduloblastomas primários (grupo de descoberta de Boston, n = 199; grupo de validação 1, grupo multicêntrico obtido de Heidelberg, n = 439; grupo de validação 2, grupo multicêntrico obtido do Medulloblastoma Advanced Genomics International Consortium - MAGIC, n = 285) e demonstrámos que cMET é um marcador do meduloblastoma do tipo SHH. A análise imunohistoquímica de cMET activado (ou cMET fosforilado) noutro grupo independente de doentes (n = 385) validou estes resultados e revelou que a activação de cMET se correlaciona com o aumento de recidivas tumorais e com uma baixa sobrevida em doentes pediátricos com meduloblastoma do tipo SHH, definido assim um subgrupo de doentes que pode beneficiar de terapêutica dirigida a cMET. Seleccionámos foretinib, um inibidor de múltiplas cinases aprovado pela FDA e com elevada afinidade para cMET, para avaliar o efeito da terapia dirigida a cMET no meduloblastoma do tipo SHH. Foretinib bloqueou a activação de cMET, reduziu a proliferação celular e induziu apoptose, tanto em linhas celulares de meduloblastoma como em tumores implantados no flanco de ratinhos. Importa salientar que caracterizámos a farmacocinética do foretinib e demonstrámos que este fármaco penetra a barreira hematoencefálica e é bem tolerado quando administrado por via intratecal. O tratamento com foretinib em ratinhos com meduloblastomas implantados no cerebelo e num modelo de ratinho transgénico com uma forma agressiva de meduloblastoma metastizado do tipo SHH (ratinho transgénico Patched+/- com sistema de transposão do tipo Sleeping Beauty) reduziu o crescimento e invasão em meduloblastomas primários, diminuiu a incidência de metástases em 36% e aumentou a sobrevida em 45%. Para investigar potenciais novas pequenas moléculas dirigidas aos meduloblastomas do Grupo 3, usámos uma plataforma bioinformática chamada Connectivity Map (C-MAP). O CMAP contém uma colecção de perfis de expressão génica de múltiplas linhas celulares humanas tratadas com um elevado número de compostos aprovados pela FDA. A análise comparativa entre assinaturas genéticas oncogénicas de interesse e a base de dados C-MAP pode detectar padrões de mudança de expressão génica e identificar pequenas moléculas com potencial actividade num determinado cancro. Assim, questionámos o C-MAP usando as assinaturas genéticas específicas dos quatro subgrupos de meduloblastoma. Piperlongumine, um produto natural extaído do fruto do Piper longum, foi identificado como o melhor candidato para os diferentes subgrupos de meduloblastoma, à excepção do tipo WNT. De seguida, seleccionámos compostos com potencial actividade antitumoral específica para os meduloblastomas do Grupo 3, tendo um inibidor das CDKs (cyclin-dependent kinases), alsperpaullone, sido o melhor classificado. Para validar os nossos resultados usámos duas linhas celulares estabelecidas representativas dos meduloblastomas do Grupo 3 (D425 e D458) e uma linha celular pluripotente obtida de um doente com um tumor do Grupo 3 (M441). Os fármacos predictos pelo C-MAP foram eficazes na diminuição da proliferação celular in vitro bem como na redução do crescimento tumoral e no aumento da sobrevida em ratinhos com meduloblastomas do Grupo 3 implantados no cerebelo. O composto alsterpaullone revelou-se o mais eficaz, quer in vitro quer in vivo, na linha celular pluripotente obtida de um doente. É interessante salientar que a caracterização do perfil químico e genómico de células de meduloblastoma do Grupo 3 tratadas com alsterpaullone confirmou a inibição de genes relacionados com o ciclo celular e a regulação negativa de MYC, o oncogene característico dos meduloblastomas do Grupo 3. Usámos no nosso estudo uma abordagem com base na expressão genética para identificar terapêuticas dirigidas para o tratamento do meduloblastoma. Os resultados apresentados demonstram a eficácia pré-clínica de duas pequenas moléculas inibidoras: foretinib para o tratamento do meduloblastoma metastático do tipo SHH e alsterpaullone para o tratamento de meduloblastomas do Grupo 3. Tendo em conta o prognóstico sombrio e a falta de opções terapêuticas nestes doentes, os resultados dos nossos estudos constituem forte evidência para que estes compostos sejam incluídos como terapias dirigidas em ensaios clínicos para doentes diagnosticados com estes subgrupos agressivos de meduloblastoma.

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