Peroxide-based hybrid and prodrug antimalarials to deliver cysteine protease inhibitors into the parasitic food vacuole

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

The discovery of new drugs for malaria is a continuous effort for medicinal chemists. The identification of resistant strains to nearly all used antimalarials is proof of the fast adaptation of the parasites and ease of resistance development. Combinations of drugs are the best weapon in therapy to avoid or at least delay resistance. Hybrid drugs have potential for drug combination in malaria treatment, with several examples throughout the literature. Artemisinin and other endoperoxide compounds play an important role in therapy since it is the class of drugs with fewer cases of resistance reported so far. Another important feature of this class of compounds is their high degree of selectivity towards parasites, as they are only activated in the presence of a high concentration of iron (II). This characteristic offers a great opportunity to develop delivery systems for drugs usually considered non specific / toxic to human cells. In Chapter II, the synthesis of dual acting tetraoxane-based hybrid molecules designed to deliver a falcipain-2 inhibitor (dipeptidyl vinyl sulfone) upon activation by iron (II) in the parasite digestive vacuole is described. These hybrids are active in low nanomolar range against two P. falciparum strains, and active in micromolar range against FP-2. We also demonstrate that a potent FP-2 inhibitor is released / unmasked upon in vitro activation of the hybrids with an iron (II) salt. This same byproduct was detected in extracts of infected erythrocytes treated with the hybrids, proving the release mechanism was effective. In Chapter III, the same delivery system was adapted to non-peptidic FP-2 inhibitors – pyrimidine nitriles – which are smaller than dipeptidyl vinyl sulfones and should resist proteolytic degradation. In addition, structure activity relationships for these drugs suggest that the introduction of the large tetraoxane moiety should not compromise FP inhibition. Indeed, hybrids showed potent antimalarial activity (from 13-80 nM versus 3D7) and good FP-2 inhibitory activity (as low as 3.4 nM). In these hybrids, potent inhibition of FP-2 is not dependent on endoperoxide activation as in the previous series. In vivo, a decrease in parasitemia and an increase in survival of mice was observed when compared to control. It should be noted that all compounds of this series showed significant effect on liver stage parasitemia, a most welcome feature for any new class of antimalarial drugs In Chapter IV, a series of compounds based on a tetraoxane pyrimidine nitrile hybrid were designed for use in localization assays. The goal is to have more insight about the place tetraoxanes are activated and the products accumulated. Considering the tetraoxane is working as a delivery system, we can also confirm if the tetraoxane interferes with the accumulation of the falcipain inhibitor. A terminal alkyne was attached to all of these compounds in order to provide fluorescence in situ, through a click reaction with a fluorescent probe. Changes made to the original hybrids are intended to minimize the impact on activity and physicochemical properties, to avoid significant differences in the accumulation profile. Preliminary results demonstrated that the introduction of the alkyne group into the pyrimidine moiety did not influence significantly the activity of the hybrid. In Chapter V, we explored new alternatives to the typical tetraoxane scaffold which is supported by an adamantane and cyclohexane side chains. The goal is to improve the chemical diversity of this class of drugs without affecting its potent activity. The interactions described between tetraoxanes and heme guided the selection of three starting materials to develop a library of new endoperoxide scaffolds. The first tetraoxane derived from these new chemicals showed single digit nanomolar activity against Plasmodium parasites, serving as a proof-of-concept of our approach. Overall, this project contributed with: two families of hybrids that displayed potent antimalarial activity with potential dual mechanism of action, which is essential to face highly adaptable parasites; new scaffolds that demonstrated to be active in the two stages of malarial infection in humans (blood and liver), which is not only significant to treat P. falciparum infections, but especially P. vivax and P. ovale, where liver parasitemia often leads to recrudencesces; a new tetraoxane structure with promising antimalarial activity.

A malária continua a ser uma das mais doenças infecciosas com maior impacto, causando mais de 600.000 mortes por ano em todo o mundo, e afectanto principalmente mulheres e crianças. Parasitas do género Plasmodium, os responsáveis por esta doença, adaptam-se rapidamente, como é demonstrado pelos relatos de resistência a quase todos os fármacos antimaláricos. A combinação de fármacos continua a ser a melhor estratégia para combater a resistência de microorganismos, como é o caso da tuberculose ou VIH. De facto, a Organização Mundial de Saúde recomenda actualmente o uso the terapias combinadas baseadas em artemisininas (“Artemisinin-based Combination Therapies” – ACTs) como primeira linha no combate à malária. A artemisinina e outros endoperóxidos são fármacos essenciais no tratamento desta doença, não só pela sua elevada actividade e rapidez de acção, mas também por serem a classe de compostos com menos casos de resistência reportados. Químicos medicinals têm abordado a combinação de fármacos com o desenvolvimento de compostos híbridos, que são combinações covalentes de um ou mais fármacos, com mecanismos de acção diferentes. Vários exemplos de híbridos demonstraram bons resultados in vitro e in vivo contra parasitas da malária. As ACTs foram também adaptadas a híbridos, aproveitando a boa actividade e rapidez de acção dos endoperóxidos, assim como a sua selectividade para os parasitas. A razão subjacente a esta selectividade é a alta concentração de ferro (II) presente nos parasitas e que não se encontra em células de mamífero. Este metal é o responsável pela activação dos endoperóxidos, levando à quebra homolítica das pontes peroxidicas em radicais tóxicos que interferem com vários alvos dentro dos parasitas. Juntamente com estes radicais, é libertada uma molécula intacta do composto inicial. Esta característica abre a possibilidade de desenvolvimento de um sistema de libertação de outros fármacos no interior dos parasitas. Por exemplo, a estrutura do endoperóxido pode mascarar a actividade de outro fármaco não selectivo, libertando-o apenas após activação por ferro (II). Na literatura, encontram-se alguns exemplos bem sucedidos desta estratégia. Dioxanos e trioxolanos foram os endoperóxidos usados nestas referências, no entanto, tetraoxanos igualmente capazes de libertar outros compostos após activação por ferro (II), não foram explorados até à data. Neste projecto, os tetraoxanos são utilizados na formação de fármacos híbridos, com o objectivo de libertar outro compostos activos dentro dos parasitas. Os fármacos seleccionados para serem associados foram inibidores de falcipaínas. Estes alvos são proteases de cisteínas que actuam no processo de digestão da hemoglobina em aminoácidos essenciais para a sobrevivência dos parasitas. A inibição destas proteases conduziu à cura de infecções por malária em modelos animais. Além disso, na literatura existem várias classes de inibidores dirigidos especialmente à isoforma falcipaina-2 (FP-2), com actividades potentes e estruturas bem definidas, pelo que são um bom ponto de partida para comprovar a viabilidade da nossa aboradagem. No início do projecto adaptou-se a série de híbridos de artemisinina – vinil sulfonas desenvolvidas previamente pelo nosso grupo. Estes compostos demonstraram excelente actividade antimalárica, mas apenas inibiram moderadamente as falcipaínas. Provavelmente o acoplamento da artemisinina na posição P3 dos inibidores peptídicos dificultou a interação com a enzima. Alterando a estrutura da artemisinina por tetraoxanos de estrutura diferente poderia promover a inibição das falcipaínas. Os resultados biológicos demonstraram que estes híbridos de tetraoxanos – vinil sulfonas são activos na mesma ordem de grandeza que os seus análogos de artemisinina, tanto contra os parasitas como contra a FP-2. No entanto, o produto libertado após activação do tetraoxano foi cerca de 26 vezes mais activo contra a FP-2 do que o híbrido correspondente. Através de estudos de “docking”, observou-se que o tetraoxano não se adaptava perfeitamente à superfície da enzima. No entanto, a cetona resultante da activação já apresentava melhor acomodação, o que pode justificar a melhor actividade contra a FP-2. Essencialmente, conseguiu cofirmar-se que os híbridos actuam por dois mecanismos de acção distintos, e que são capazes de libertar um produto activo dentro dos parasitas. Apesar de estes híbridos demonstrarem actuar por dois mecanismos de acção, para haver inibição apropriada das falcipaínas, é necessário haver activação do tetraoxano para se libertar um inibidor mais competente, o que não é ideal. De modo a enfrentar o desenvolvimento de resistências, é preferível que ambos os mecanismos de acção actuem independentemente. Na segunda série de híbridos, foram utilizados inibidores de falcipaina não-peptídicos – cianopirimidinas – uma vez que resistem a degradação proteolítica e são também altamente activos. Além disso, as relações de estrutura-actividade sugerem que estes compostos aceitam vários tipos de substituintes na posição P3 sem comprometer a actividade contra as falcipaínas, o que contrasta com a série anterior. Ensaios biológicos demonstraram clara melhoria da actividade contra a FP-2, mantendo a actividade contra os parasitas na mesma ordem de grandeza da série anterior. Foi possível observar que o tetraoxano se acomoda adequadamente na subunidade S3 da FP-2, o que justifica a melhor inibição por parte do híbrido. Foi também demonstrado que se liberta um produto igualmente potente após activação do tetraoxano por ferro (II), à semelhança da série anterior. É de salientar que todos os compostos da série tetraoxano – cianopirimidinas foram activos nos dois estadios de infecção por malaria em humanos – sangue e fígado – uma propriedade muito desejável clinicamente, em especial no tratamento de infecções por P. vivax e P. ovale, pela sua capacidade de evoluirem para formas adormecidas no fígado. Na literatura encontram-se relatos de que os produtos de activação dos endoperóxidos acumulam-se em estruturas lipídicas localizadas à volta do vacúolo digestivo dos parasitas. Isto foi comprovado para derivados semi-sintéticos da ART e para trioxolanos. De forma a obter mais informações sobre productos de activação dos nossos híbridos derivados de tetraoxanos, programou-se uma série de compostos semelhantes à série anterior, para serem visualizados por microscopia confocal de fluorescência. Estas moléculas contêm um grupo alcino que será utilizado para fornecer fluorescência in situ, através de reacções click com sondas. A síntese destes compostos mostrou-se desafiante, pelo que os resultados biológicos não foram efectuados a tempo para inclusão nesta Tese. Apesar do tempo investido na optimização de tetraoxanos antimaláricos, a variabilidade de estruturas que suportam as pontes peroxídicas é geralmente limitada à combinação de um grupo adamantano e ciclohexano. No último capítulo experimental desta tese, investiu-se na pesquisa de novas estruturas capazes de manter a actividade antimalárica dos endoperóxidos sintéticos mais bem sucedidos (ex: OZ439 e RKA182), mas também que fosse capaz de ser adaptado para libertar fármacos com outro tipo de estruturas dentro dos parasitas, assim como demonstrado pelos híbridos já descritos. Do primeiro conjunto de materiais de partida testados com este objectivo, a 2-indanona foi o mais bem sucedido. Os tetraoxanos derivados deste reagente foram obtidos com bom rendimento, e os resultados preliminares de actividade antimalárica demonstraram IC50 na ordem dos baixos nanomolar contra uma estirpe de P. falciparum resistente à cloroquina. As modificações testadas na estrutura destes novos compostos não foram bem sucedidas até à data, mas a oportunidade de desenvolver uma nova série de compostos altamente activos merece ser explorada. De uma forma geral, este projecto contribuiu com: duas séries de fármacos hídridos altamente activos contra o P. falciparum, e que demonstraram actuar por dois mecanismos de acção distintos, o que é importante para o tratamento de parasitas que se adaptam facilmente, adquirindo resistência; uma série de compostos que demonstraram ser activos nos dois estadios de infecção por parasitas da malária no humano (sangue e fígado), o que não é só clinicamente significativo para o tratamento do infecções por P. falciparum, mas também por P. vivax e P. ovale, onde a parasitémia hepática causa muitas vezes recrudencências; uma nova estrutura que resulta em tetraoxanos com elevado potencial antimalárico.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/63200/2009)