Synthesis and computer-assisted design of mitochondrial electron transport-chain inhibitors as antimalarial agents

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Malaria remains a critical global health problem, with terrible social and economic consequences in countries where this disease is endemic. The problem is exacerbated by the emergence and spread of parasites that are resistant to well-established antimalarial drugs. As a result, there is an urgent need for novel drugs, preferably acting on under exploited parasite targets in order to overcome clinical resistance. Cytochrome bc1 complex is a crucial element in the mitochondrial respiratory chain, being indispensable for the survival of several species of Plasmodia that cause malaria and, therefore, it is a promising target for antimalarial drug development. Moreover, in the absence of a crystal structure for the P. falciparum bc1 complex, key structural and mechanistic information has been inferred from analogous mammalian, bacterial and yeast bc1 systems. In the present work, a molecular docking study based on the most recently obtained X-ray structure of the Saccharomyces cerevisiae bc1 complex (PDB code: 3CX5) and using several reported inhibitors with experimentally determined IC50 values against the Plasmodium falciparum bc1 complex is presented. This Qo model was also used to search the drug-like database included in the MOE package for novel potential bc1 complex inhibitors allowing to obtain five compounds with demonstrated activity against the chloroquine-resistant W2 strain of P. falciparum. Moreover, the most active compounds were also active against the atovaquone-resistant P. falciparum FCR3 strain and S.cerevisiae. Furthermore, considering that a reliable three-dimensional structure of this Pf enzymatic complex is essential for successful drug design and having in mind the increasing interest in obtaining potential antimalarial drugs that can act in this target, a homology model of cytochrome bc1 Qo binding site was further developed based on yeast crystallographic structure. Additionally, a library containing several structurally diverse aurone and azaaurone derivatives were also synthesized and tested for their antimalarial activity. The aurone derivatives synthesized showed to be moderate active with IC50 values in the low micromolar range while de azaaurone analogous presented much higher potency with some compounds being active in the nanomolar range. Despite the mechanism of action of these two classes of compounds is still not very clear, this study highlight the usefulness of aurones and azaaurones to be derivatized in order to rapidly deliver lead compounds for further optimization and also the potential of these two scaffolds as promising antimalarial compounds.

A malária continua a ser um grave problema de saúde, com enormes consequências sociais e económicas que afectam os países onde esta doença é endémica. Este problema tem vindo a crescer devido ao agravamento do aparecimento de parasitas resistentes aos fármacos antimaláricos disponíveis. Apesar da importância geral desta doença, o desenvolvimento de novos fármacos tem sido negligenciado pela indústria farmacêutica nos países industrializados. Deste modo, existe uma necessidade urgente de obter novos fármacos, de preferência que actuem em alvos menos explorados, de modo a se poder superar todos os problemas relacionados com a resistência. Nos últimos anos o esforço para desenvolver novos fármacos tem vindo a aumentar sendo que várias parcerias entre a indústria e a academia têm mesmo sido formadas. Esta união de esforços permite não só expandir o conhecimento existente acerca de fármacos antimaláricos mas também potenciar o progresso na obtenção de novos fármacos. Devido à complexidade do ciclo de vida do parasita, vários alvos têm sido utilizados nos últimos tempos de modo a permitir desenvolver um fármaco que seja eficiente e selectivo para o parasita. Um desses alvos é a cadeia de transporte electrónico que inclue o citocromo bc1. O citocromo bc1 é um elemento crucial para o correcto funcionamento da cadeia de transporte electrónico do parasita. Sendo essencial para a sobrevivência do parasita responsável pela malária, este pode ser considerado um alvo promissor para o desenvolvimento de fármacos antimaláricos. Na ausência de uma estrutura cristalográfica do citocromo bc1 do P. falciparum, toda a informação acerca da sua estrutura e do seu mecanismo tem sido obtida através de estudos desenvolvidos nos seus análogos provenientes de mamíferos, bactérias e leveduras. Neste projecto desenvolveu-se inicialmente um estudo de docking molecular com base na estrutura cristalográfica do citocromo bc1 da levedura Saccharomyces cerevisiae (PDB 3CX5) e utilizando vários inibidores conhecidos com valores de IC50 determinados experimentalmente. Tal permitiu analisar a possibilidade de a estrutura cristalográfica da levedura poder ser utilizada como um bom modelo para o P. falciparum. Mais importante, permitiu também compreender o modo de interacção dos inibidores seleccionados com o centro activo Qo e prever o potencial inibitório destas moléculas. Este modelo foi posteriormente utilizado para se proceder a um estudo de screening virtual utilizando a biblioteca de compostos incluída no programa MOE. Este estudo permitiu obter cinco compostos com actividade antimalárica contra a estirpe W2 resistente à cloroquina. Os compostos mais activos demonstraram também actividade contra a estirpe resistente à atovaquona e contra a levedura. Infelizmente, os estudos biológicos feitos especificamente na cadeia de transporte electrónico não permitiram comprovar que estes compostos actuam definitivamente neste alvo. Tendo em conta a importância de se ter uma estrutura tridimensional adequada para se poder desenhar novos inibidores e considerando o crescente interesse neste alvo, procedeu-se ao desenvolvimento de um modelo por homologia do sítio activo Qo do citocromo bc1 do P. falciparum com base numa estrutura cristalográfica conhecida. Para tal, procedeu-se a um estudo inicial das estruturas cristalográficas deste alvo disponíveis de várias espécies e fez.se a uma comparação exaustiva de modo a seleccionar o melhor modelo. A S. cerevisiae foi a espécie escolhida devido ao grau de homologia entre as duas estruturas homólogas e a resolução da sua estrutura cristalográfica. O modelo por homologia foi desenvolvido utilizando as ferramentas disponíveis no MOE e foi validado utilizando técnicas de docking e screening virtual. Este estudo de screening foi efectuado com base na mesma biblioteca de compostos utilizada anteriormente e permitiu identificar novas moléculas com estruturas químicas bastante interessantes e com potencial para actuar neste alvo. Os dados biológicas destas moléculas não estão ainda disponíveis não permitindo definitivamente validar este modelo por homologia como o modelo mais correcto da estrutura cristalográfica do sítio activo Qo do citocromo bc1 do P. falciparum. Apesar disso, foi feito um enorme avanço em termos de obter uma estrutura tridimensional mais fidedigna deste alvo o que será útil para desenvolver novos inibidores selectivos para o citocromo bc1. Na segunda parte deste trabalho, uma biblioteca de compostos contendo diversos derivados de auronas e azaauronas foi também sintetizada e testada para avaliar a sua actividade antimalárica. As auronas são produtos naturais com actividade antiparasitária já reconhecida. Estes compostos foram primeiramente sintetizados com o objectivo inicial de obter estruturas quimicamente diversas e mais complexas de modo a permitir reconhecer que tipo de alterações permite aumentar o seu potencial antimalárico. Deste modo foram sintetizados vários compostos recorrendo a reacções de acoplamento catalisadas por paládio, como as reacções de Suzuki e Buchwald, devido à facilidade de aumentar rapidamente uma biblioteca de compostos utilizando estes procedimentos. Foram também sintetizados alguns derivados por introdução de uma amina alifática no anel A da aurona de modo a obter bases de Mannich. As moléculas sintetizadas mostraram actividade moderada contra o P. falciparum com valores de IC50 na ordem dos micromolar. Foram feitos ainda vários estudos biológicos com o objectivo de se identificar o modo de acção desta classe de compostos mas tal não foi possível. Novos estudos terão ainda que ser feitos. Os derivados de azaauronas foram obtidos de um modo semelhante ao utilizado para os derivados de auronas. Contudo, neste caso, foi necessário utilizar um método de síntese convergente de modo a se obter os compostos mais eficientemente. Tal deveu-se a problemas associados ao facto de a síntese destes compostos ser mais complexa e menos eficiente que a síntese dos derivados de auronas o que levou não só a uma diminuição do rendimento das reacções mas também a um aumento considerável de produtos secundários e, consequentemente, a um acréscimo na dificuldade em isolar os produtos. Ao contrário dos derivados de auronas, estes novos compostos demonstraram ser bastante mais activos que os seus análogos com valores de IC50 na ordem dos nanomolar. Mais ainda, estes compostos apresentam também citotoxicidade negligenciável. Dado que estes compostos contêm um aceitador de Michael na sua estrutura, foram testados contra a falcipaína-2, uma protease muito importante para a degradação de hemoglobina no vacúolo digestivo do parasita e essencial para a sua sobrevivência. Infelizmente os resultados obtidos indicam que este não é o alvo desta classe de compostos dado que apenas três apresentaram baixo poder inibitório na ordem dos 10 μM. Foi feito ainda um estudo de sinergismo na presença de cloroquina e mefloquina que permitiu demonstrar o potential sinergístico desta classe de potenciais antimaláricos. Mais ainda, a semelhança estrutural destes compostos com as quinolonas, reconhecidos inibidores do citocromo bc1, e os estudos de docking efectuados com base no modelo por homologia desenvolvido anteriormente permite sugerir que seja este o alvo desta classe de compostos. Contudo, estudos biológicos adicionais serão necessários para identificar o modo de acção dos derivados de azaauronas. Finalmente, apesar de o modo de acção destas duas classes de compostos não estar ainda completamente identificado, o estudo desenvolvido demonstra que tanto as auronas como as azaauronas podem ser derivatizadas de modo a se obter novos compostos mais activos. Mais ainda, estas duas classes de compostos podem ser consideradas promissoras no desenvolvimento de fármacos antimaláricos. O estudo desenvolvido pode ser então considerado um passo importante não só na caracterização de um importante alvo terapêutico para a malária mas também na identificação de novas classes de compostos com potencial para ser posteriormente optimizadas de modo a obter novos fármacos antimaláricos com actividade relevante.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/61611/2009 e projetos PTDC/SAU-FCT/098734/2008, PTDC/SAU-FAR/118459/2010 e Pest-OE/SAL/UI4013/2011)