New approaches for the diagnosis of human papillomavirus infection:relevance for clinical practice and cancer prevention

Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

A relação entre a infecção pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) e o desenvolvimento do cancro do colo do útero foi estabelecida no final do século XX. Em Portugal, preconiza-se o rastreio do cancro do colo do útero na mulher adulta por constituir uma das neoplasias mais frequentes. Foram recentemente implementados programas de rastreio numa base regional; contudo, o respectivo impacto na redução do número de casos de cancro do colo do útero levará algum tempo. Por outro lado, o recurso a potenciais indicadores de prognóstico, permitirá auxiliar a identificação precoce de mulheres em risco de desenvolver cancro do colo do útero, contribuindo para o estabelecimento de estratégias de prevenção mais efectivas e eficazes. A vacina profiláctica contra a infecção por HPV foi recentemente disponibilizada para administração à população feminina jovem, tendo sido incluída no plano nacional de vacinação. Neste contexto, torna-se importante conhecer os genótipos circulantes na população Portuguesa, de forma a prever o impacto da vacinação (apenas inclui dois ou quatro genótipos de HPV) na infecção por HPV e nas lesões a esta associada. O presente trabalho de doutoramento teve os seguintes objectivos: 1) determinação da proporção da infecção pelos diferentes genótipos de HPV numa amostra da população feminina Portuguesa (obtida por rastreio oportunista), e respectiva associação com o diagnóstico citológico; 2) avaliação dos testes de detecção e genotipagem do HPV relativamente à clínica associada; 3) avaliação de diferentes indicadores de prognóstico, de acordo com o diagnóstico clínico; e, 4) desenvolvimento de um modelo matemático aplicável ao estudo da infecção genital por HPV. A determinação da frequência dos diferentes genótipos de HPV foi efectuada numa população com sinais clínicos sugestivos de infecção por HPV, tendo sido possível estabelecer associações significativas entre as alterações clínicas e a infecção persistente por genótipos de alto risco. Adicionalmente, foi possível identificar os genótipos mais frequentes, nomeadamente os HPV 16, 18, 31, 51, 53 e 66, e verificar que a infecção por HPV é mais frequente nas mulheres até aos 29 anos, sobretudo devido à multiplicidade de contactos e de parceiros sexuais (maioritariamente infecções transitórias). Já nas mulheres com idade superior a 30 anos, a infecção por HPV foi menos frequente mas apresentou maior risco de persistência e, dada a elevada proporção de genótipos de alto risco (mesmo em mulheres com citologia normal – assintomáticas), constituiu, por si só, um importante factor de risco para o desenvolvimento de cancro do colo do útero.Foi efectuada uma caracterização epidemiológica da infecção por HPV, assim como dos programas de rastreio do cancro do colo do útero em Portugal, tendo sido salientadas as especificidades do rastreio em cada região. O desempenho de diferentes testes comerciais de detecção e genotipagem do HPV foi avaliado de acordo com a clínica (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo). A compreensão dos princípios e fundamentos de cada metodologia facilita uma correcta apreciação do respectivo desempenho laboratorial em fases distintas da infecção por HPV, assim como da sua aplicabilidade a programas de rastreio. Os testes de detecção do DNA viral, com elevada sensibilidade, revelaram constituir uma boa alternativa à recorrente citologia, enquanto teste de rastreio primário. De facto, a abordagem conjunta de teste HPV com triagem citológica, especialmente nas mulheres com mais de 30 anos, permitirá alargar o tempo de intervalo entre os exames de rastreio, devido ao elevado valor preditivo negativo do teste HPV. Mais, os testes de detecção do DNA viral, que incluem a genotipagem dos HPV 16 e 18 (oncogénicos e frequentemente associados ao desenvolvimento de lesões precursoras de cancro do colo do útero), possibilitam estratificar mais eficazmente as mulheres em maior risco de persistência da infecção viral e respectivas consequências clínicas. Relativamente à detecção de RNAm do HPV, foi avaliada uma metodologia comercial de detecção e genotipagem de transcritos de RNAm para alguns genótipos de HPV de alto risco (NASBA). Esta metodologia permite a identificação precoce de infecções clinicamente relevantes por compreenderem um risco acrescido de desenvolvimento de lesões precursoras do cancro do colo do útero. Verificou-se que a utilização desta metodologia como teste de segunda linha pode aumentar a especificidade do teste de detecção de DNA do HPV nas mulheres infectadas, reduzindo a indicação clínica para colposcopia (que inflige elevada morbilidade e ansiedade na mulher) como método de rastreio das lesões associadas à infecção por HPV, e evitando o tratamento excessivo, ao possibilitar excluir lesões com maior probabilidade de regressão. A utilização de diferentes indicadores de prognóstico da infecção por HPV facilitará a identificação precoce de mulheres em risco de desenvolvimento de lesões precursoras de cancro do colo do útero. Neste contexto, foram avaliadas a carga viral e o estado físico do DNA viral dos HPVs 16 e 18, tendo sido possível determinar uma associação entre o aumento da carga viral do HPV 16 e a gravidade da lesão do colo do útero, pelo que foi considerado como um importante marcador de prognóstico em mulheres infectadas por um dos mais frequentes genótipos de alto risco na população Portuguesa. Para o HPV 18, frequentemente associado ao desenvolvimento de adenocarcinomas (tipo de cancro cervical de difícil identificação citológica), verificou-se que a carga viral é potencialmente preditiva da persistência da infecção.A determinação do estado físico do DNA viral, como metodologia alternativa a procedimentos médicos invasivos (colposcopia e biopsia), foi avaliada em associação com o diagnóstico citopatológico. Durante o processo de carcinogénese viral ocorre integração do genoma viral no genoma da célula hospedeira, por disrupção do gene viral E2 e subsequente sobre -expressão dos oncogenes virais E6 e E7. Foi possível identificar, especialmente para o HPV 18, uma associação entre a presença de formas lineares (maior risco), as lesões precursoras e os casos de adenocarcinoma, o que sugere a utilidade clínica deste indicador de prognóstico para as mulheres infectadas por HPV 18. No caso do HPV 16, a associação entre a determinação do estado físico do DNA viral e o diagnóstico citopatológico não foi tão evidente, pelo que outros mecanismos virais poderão estar associados à transformação maligna que antecede o desenvolvimento de cancro do colo do útero. Por último, o desenvolvimento de um modelo matemático aplicado à infecção genital por HPV incluiu transições entre os diferentes estadios clínicos que correspondem ao processo de carcinogénese viral. Os cenários previstos foram extrapolados a partir da população de estudo (de rastreio oportunista) e posteriormente comparados com uma população Portuguesa de referência (de rastreio organizado), por forma a estimar a evolução e flutuações relacionadas com a infecção por genótipos de HPV de alto risco e respectivas lesões associadas. A utilização eficaz da vacina a nível mundial poderá levar a uma diminuição de casos de cancro do colo do útero na ordem dos 70% (valor estimado de cancros associados à infecção por HPV 16 e 18), decorrente da prevenção vacinal para os referidos HPVs. No entanto, a existência de uma proporção considerável de outros genótipos de alto risco não incluídos nas vacinas disponíveis poderá alterar esta estimativa, pelo que a monitorização constante dos genótipos circulantes de HPV será importante. De facto, estima-se que sejam necessárias algumas décadas até eliminar os casos de infecção associados aos HPV 16 e 18, já que a grande maioria das mulheres já foi exposta à infecção por HPV.

Cervical cancer development has been aetiologically linked to human papillomavirus (HPV) infection. In Portugal, routine screening for cervical cancer has been regionally implemented and was recommended for adult women because it constitutes one of the most frequent malignancies for women aged 15 to 44 years. HPV prophylactic vaccination (which only includes two or four oncogenic genotypes) was made available in the last decade for young girls, but the knowledge of HPV circulating genotypes is crucial for predicting its clinical impact. This PhD thesis comprised the following objectives: 1) assessment of the proportion of HPV genotypes among Portuguese women (opportunistic screening) according to cytological diagnosis; 2) clinical evaluation of several HPV tests; 3) evaluation of some prognostic markers according to the clinical diagnosis; 4) development of a mathematical model applied to genital HPV infection. Portuguese HPV epidemiology and screening programs were characterized, highlighting the specificities of screening in each region. The most frequent genotypes were HPV 16, 18, 31, 51, 53 and 66, and HPV infection was more common in women aged less than 29 years. In women over 30 years, HPV infection was less frequent but tend to persist and to involve high-risk genotypes. HPV DNA tests demonstrated high sensitivity, constituting an alternative to cytology in primary screening, while combined with cytology (especially for women over 30 years) would extend the re-screening testing interval, considering the high negative predictive value of HPV testing. Moreover, HPV DNA tests with concurrent identification of HPV 16 and 18 (most associated genotypes to cervical cancer development) will provide a better risk stratification of women for precancerous cervical lesion development. The detection of HPV mRNA is highly specific in identifying clinical cervical disease, so that its recommendation to reflex testing of HPV DNA-positive women has shown to reduce colposcopy referral, avoiding over-treatment by excluding cervical lesions that would most likely regress (with associated morbidity and anxiety to HPV-infected women). The viral load and physical status of high-risk HPV 16 and 18 were evaluated as prognostic markers in women at risk of developing cervical precancerous lesions. An association between increased HPV 16 viral load and severity of cervical lesion was observed suggesting its prognostic value, whereas for HPV 18, viral load was only predictive of HPV persistency. The presence of linear forms (higher risk) in HPV 18-associated precancerous lesions and adenocarcinomas evidenced the potential clinical utility of viral DNA physical status as a prognostic marker for women infected with HPV 18. The association was not evident for HPV 16, suggesting that other viral mechanisms should be responsible for malignant host cell transformation.Finally, the mathematical model applied to genital HPV infection included transition probabilities between disease states corresponding to different steps of cervical carcinogenesis, and provided scenarios for a Study Population (opportunistic screening), for a Reference Population (routine screening) and for a Hypothetical Population, which were further compared to predict HPV vaccination impact. Estimates of trends and fluctuations associated with high-risk HPV genotype infections and its associated cervical lesions were performed. HPV vaccines may lead to a global decrease of cervical cancer cases of about 70%, considering that most cervical cancers are associated with HPV 16 and 18 infections. However, the existence of a considerable proportion of other highrisk genotypes not included in the currently available HPV vaccines may change this estimate. Thus, the constant monitoring of circulating HPV genotypes remains of particular importance. Furthermore, the vast majority of women have been exposed to HPV infection, alerting to the importance of a continuous follow-up and establishment of public health measures through routine screening, while improving women’s welfare.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/47044/2008)