Utilização da levedura como sistema de produção de uma proteína da cápside de um novo norovirus canino

Dissertação de mestrado em Genética Molecular

Os norovirus (NoV) são actualmente reconhecidos como uma das causas mais comuns de surtos de origem alimentar de gastroenterite aguda e esporádica. Embora as vias de transmissão mais importantes sejam o contacto entre pessoas e o consumo de alimentos contaminados surgiu, ainda recentemente, a possibilidade de ocorrer também uma transmissão zoonótica. A descoberta de um novo NoV canino no norte de Portugal e o potencial risco de transmissão zoonótica motivaram a investigação da ecologia deste vírus. A inexistência do um teste serológico comercial e a sua importância para a pesquisa em curso levounos a tentar implementar um ensaio imunoenzimático. Para implementar este ensaio são necessárias quantidades significativas de VLP’s (virus-like particles) para serem utilizadas como antigénios. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada na produção de proteínas virais, incluindo proteínas da cápside. Assim, o objetivo deste trabalho foi utilizar o sistema de elevada expressão e baixo custo de S. cerevisiae para produzir a proteína da cápside do novo NoV canino, VP1 (que forma espontaneamente VLP’s), em quantidades suficientes para ser utilizada como antigénio no ensaio imunoenzimático. Com este objetivo, o gene VP1 foi inserido num vetor multicópia para expressão em levedura e a proteína foi fundida com um tag 6HIS no terminal C´. A inserção do tag 6HIS permite não só a deteção e quantificação da proteína recombinante por Western Blot, mas também, e sobretudo, a purificação da proteína VP1 num único passo por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC). A produção da proteína VP1 na levedura foi otimizada para a estirpe e para as condições de crescimento e a purificação foi realizada por IMAC e analisada por coloração do gel com azul de Coomassie e Western Blot. O produto obtido corresponde a uma massa molecular esperada de 63 kDa e o rendimento obtido foi de 1,38 mg/g de peso húmido de levedura. As propriedades imunológicas da proteína recombinante VP1-6HIS foram avaliadas através da realização de um ensaio imunoenzimático e a sua antigenicidade demonstrada ao confirmar a serologia de várias amostras caninas. Encontram-se em curso estudos de microscopia eletrónica para avaliar se a proteína produzida é capaz de formar VLP’s. Em conclusão, neste trabalho implementamos um sistema rápido e eficiente para a produção e purificação da proteína VP1 da cápside do novo NoV canino.

Norovirus (NoVs) are now recognized as the most frequent cause of foodborne outbreaks of acute gastroenteritis and the most common cause of sporadic enteric illness. Though the most important modes of transmission are person-to-person contact and consumption of contaminated food, zoonotic transmission has been recently suggested. Several studies have found evidence of human infections by strains of cattle and infections of pigs for human NoVs. The discovery of a new NoV canine in the north of Portugal and the potential risk of zoonotic transmission compelled to explore the ecology of this virus. The absence of a commercial serological test VLP (virus-like particle)-based Enzyme Immunoassay (EIA) and its importance to the ongoing research has led us to implement an in-house EIA. To establish this assay, it was necessary a substantial number of VLP’s to be used as an antigen. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used for the production of viral proteins, including capsid proteins. Hence, the aim of this work was to use S. cerevisiae, as a cost-effective and high-level expression system, to produce sufficient amounts of the novel NoV capsid protein, VP1 (which selfassembles into VLP’s), to be used as antigen in the in-house EIA assay. With this goal, the VP1 gene was cloned into a multicopy yeast expression vector and the protein was fused, at the C´ terminus, to a 6HIS tag. The 6HIS tag allows not only the detection and quantification of recombinant proteins in Western Blot, but also, and most importantly, to perform a one-step purification of VP1 by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The production of VP1 in yeast was optimized for the strain and growth conditions used and the purification performed by IMAC was analyzed by Coomassie blue staining of SDS-PAGE and Western Blot. The obtained product corresponded to an expected molecular weight of 63 kDa and the yield obtained was 1,38 mg/g wet weight of yeast. The immunological properties of the recombinant VP1- 6His protein were evaluated by in-house EIA and its efficiency proved by confirming the serology of several canine samples. Studies of electron microscope are under way to evaluate if this VP1 is able to form VLP’s. In conclusion, in this work we present a fast and efficient system of production and purification of the canine NoV VP1capsid protein.