Loss of Par3 leads to aberrant divisions and faster mitotic progression in differentiating primary murine keratinocytes

Dissertação de Mestrado, Oncobiologia: Mecanismos Moleculares do Cancro, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Todas as células que constituem o organismo foram geradas através de sucessivas divisões celulares a partir de uma única célula: o ovo fertilizado. Durante o desenvolvimento e estado adulto existe um controlo exato dos processos de divisão, polaridade e destino celular de forma a produzir, controlar e manter os diferentes tipos de tecido que constituem um organismo adulto. Entre estes, o tecido epitelial é de particular interesse pois é responsável pela constituição da maioria dos órgãos nos mamíferos nos mais diversos contextos. Esta multiplicidade implica um leque alargado de funções diferenciadas e extremamente especializadas que só podem ser atingidas através de um grau de organização elevado por partes das células epiteliais de modo a gerar e manter a arquitetura do tecido. Paralelamente, a grande maioria dos cancros humanos provêm de tecidos epiteliais. De facto a perda da polaridade e a desorganização tecidular são pré-requisitos para a formação de tumores epiteliais e sua progressão. A polaridade apico-basal assenta na ação concertada de proteínas que medeiam a polaridade e que são controladas por sinais externos e internos, tais como factores de crescimento ou sinais do citoesqueleto. Essas proteínas organizam-se em três complexos distintos: Scribbles, Par e Crumbs que foram identificados em invertebrados e que são conservados em mamíferos tanto estrutural como funcionalmente. A disrupção de qualquer um destes complexos já foi demonstrada contribuir para génese de tumores nos mais diversos contextos. Dos três complexos, o PAR tem a função mais alargada, estando envolvido na polaridade apico-basal, polarização neuronal e migração direcionada de células T. O complexo PAR é constituído por duas proteínas Par (partitioning defective), Par3 e Par6 com funções estruturais e aPKC (atypical Protein Kinase C), uma serina-treonina cinase. Par3/Par6/aPKC conseguem formar um complexo ternário, no entanto Par3 dissocia-se do mesmo após fosforilação por aPKC. O complexo Par está envolvido em decisões de destino celular pois transmite sinais apicais para regular o alinhamento e orientação do fuso mitótico. Durante uma divisão celular orientada, a célula tem de alinhar o eixo de divisão paralela ou perpendicularmente em relação ao eixo do tecido. Esta diferente orientação está acoplada à regulação do destino celular. Se ambas as células filha têm o mesmo destino designa-se por divisão celular simétrica, ou no caso das células filhas terem destinos diferentes é designado por divisão celular assimétrica. A orientação da divisão envolve o alinhamento do fuso mitótico como o eixo de polaridade celular. Proteínas de polaridade como Par3, aPKC e Par6 permitem a transdução de estímulos externos e sinais da maquinaria intracelular para estabelecer a polaridade no interior da célula. Tecidos que proliferam e se autorrenovam mantêm a homeostasia através do rácio entre a manutenção de células estaminais e a geração de células filhas que se comprometem numa via de diferenciação. Sabemos hoje, que as células estaminais podem ser determinantes e até causativas na formação de tumores e que decisões de destino celular defetivas podem contribuir para o comportamento anormal das células estaminais. A pele é o maior órgão dos mamíferos e representa a primeira linha de defesa do organismo contra agressões externas. É composta por dois compartimentos: um à superfície forrado por epitélio, designado por epiderme e outro mais profundo com propriedades conectivas e de nutrição designado por derme. A epiderme é um epitélio estratificado com capacidade de auto renovação. Numa epiderme normal e saudável, existe um balanço entre a proliferação celular que ocorre na camada basal, a diferenciação das camadas suprabasais e a morte celular. Alterações neste balanço podem resultar em processos de renovação e reparação celular deficientes ou aberrantes que podem em último caso, levar ao envelhecimento da pele, hiperplasias ou até mesmo cancro. Na verdade, a epiderme está em contacto direto com diversos fatores oncogénicos como agentes patogénicos, químicos e radiação ultravioleta (UV) que estão associados ao aparecimento de neoplasias. No entanto uma questão que continua em aberto é como a alteração da polaridade pode alterar este equilíbrio, especialmente através dos processos de divisão celular. Foi anteriormente demonstrado que a perda da proteína Par3 na epiderme murina resultava em fenótipos diferenciados dependendo do contexto. Através de um modelo clássico de indução e promoção da génese de tumores através de DMBA/TPA, a perda de Par3 resultou num menor número e tamanho de papilomas (tumores benignos epiteliais), mediados pela localização errónea da cinase aPKC fora das junções intercelulares, acompanhados por apoptose e redução da proliferação celular. Estes resultados sugeriram uma função oncogénica para Par3 na epiderme murina. Porém os papilomas que se formaram demonstraram-se muito invasivos. Inesperadamente a perda de Par3 também predispôs os animais para a formação de queratoacantoma, um tipo de neoplasia muito rara em M. musculus mas frequentemente observadas em humanos. Desta forma Par3 atua na epiderme murina tanto como oncogene ou gene supressor de tumores dependendo do contexto. Considerando o papel do complexo Par no destino celular e génese de tumores, o objectivo deste trabalho é estudar o efeito da perda de Par3 sobre a divisão celular e o seu contributo para a génese de tumores em queratinócitos epidérmicos murinos durante homeostasia e stress mediado por radiação ultravioleta. Neste estudo observámos que a perda de Par3 em queratinócitos primários predispôs para divisões celulares aberrantes em condições de diferenciação. Paralelamente, os queratinócitos Par3 KO que progrediram através de uma divisão celular correta, demonstraram passar menos tempo em mitose que os controlos, sugerindo uma progressão mitótica mais rápida. Demonstrámos igualmente que a indução da diferenciação leva a amplificação de centrossomas e aneuploidia in vitro mas independentemente do genótipo. Observou-se também que, em condições de não diferenciação a perda de Par3 levou ao aparecimento de fuso mitóticos multipolares. De seguida foi avaliado o ciclo celular nas duas populações de queratinócitos: as célulasPar3 KO demonstraram um perfil de FACS comparável ao dos controlos aquando da diferenciação, sugerindo um perfil de diferenciação precoce. A perda de Par3 predispôs as células primárias para uma mais rápida progressão mitótica após irradiação por UV. Ao analisarmos a área do núcleo, as células Par3KO demonstraram ter uma maior área nuclear quando comparadas com os controlos nas condições de não diferenciação. Analisou-se a resposta ao dano no ADN através do marcador 53BP1. Em condições de não diferenciação após irradiação das células, os queratinócitos Par3 KO demostraram responder ao dano no ADN de forma diferenciada quando comparados com os controlos. Nas secções de queratoacantomas das nossas experiências in vivo observámos divisões celulares assimétricas, simétricas e aberrantes. Este estudo aponta para uma possível nova função de Par3 na regulação da progressão mitótica durante a homeostasia e stress induzido por radiação UV. Os queratoacantomas são tumores de crescimento rápido que advêm de áreas da pele exposta à radiação solar, no entanto a sua etiologia é pouco conhecida. As nossas observações contribuem para a compreensão do impacto da perda de polaridade na homeostasia tegumentar e abrem possíveis vias para o entendimento da génese dos queratoacantomas.