Characterization of pro- and anti-angiogenic factors in models of diabetic retinopathy

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Diabetic retinopathy (DR) is a microvascular complication associated with Diabetes mellitus (DM) and the leading cause of blindness in developed countries. Hyperglycemia and hypoxia are suggested to play essential pathophysiological role in the onset, progression and prognosis of DR. Moreover, hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), which is stabilized under hypoxic conditions, acts as a transcription factor of several genes such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and glucose transporter 1 (GLUT1). It was also described that an imbalance between pigment epithelium-derived factor (PEDF), a potent angiogenic inhibitor, and VEGF, the major angiogenic stimulator, is present in patients that suffer of DR. However little is known about the role of this imbalance in DR progression. Therefore the goal of this study was to characterize the expression of GLUT1, pro-, and anti-angiogenic factors involved in the development and progression of DR, using in vitro and in vivo models of the disease. The present study demonstrates that in D407 cells, an immortalized retinal pigmented epithelium (RPE), the levels of the glucose transporter GLUT1 are increased in the response to hypoxia and hyperglycemia and this increase is more pronounced in the cell membrane fraction. Additional support to our in vitro results is the fact that GLUT1 expression levels are increased in Ins2Akita mice, a model of type 1 DM. Regarding PEDF expression in vitro, there was no significant difference between tested conditions, but we observed the tendency to decrease in hypoxic conditions. In vivo, we could see a significant decrease of PEDF expression in the retina of 6 month-old mice; but the key result is the marked decrease detected in the RPE cell layer. VEGF mRNA levels were increased in vitro and in vivo at 6 month-old animals, but this was not observed for the protein levels. At 12 months of age, mRNA levels were similar in WT and diabetic mice, but the protein levels are significantly decreased in diabetic mice, a potential consequence of the overall senescence observed for these animals. Taken together, these results suggest that the increase in GLUT1 and the decrease in PEDF expression levels are associated with the development of diabetic retinopathy.

A retinopatia diabética (DR) é uma complicação microvascular da retina que causa cegueira a mais de 10 000 pessoas diabéticas anualmente. Esta doença resulta da exposição prolongada da retina a elevados níveis de glucose resultantes do estado diabético. Os processos envolvidos no desenvolvimento das complicações associadas à diabetes são ainda desconhecidos, no entanto pensa-se que estas poderão estar associadas a uma maior captação da glucose por parte da retina e a uma exposição prolongada à hipóxia que leva à neovascularização da retina. A glucose é transportada na barreira hemato-retiniana através do transportador GLUT1, que é regulado pela concentração sanguínea de glucose e pelo fator indutor de hipóxia, HIF-1. O HIF-1 tem um papel importante em condições de hipoxia pois funciona como factor de transcrição de vários genes importantes como o VEGF, que é o principal potenciador da neovascularização. Também foi descrito que pacientes que sofrem DR possuem um desequilíbrio entre os fatores pro-angiogénicos e anti-angiogénicos como o VEGF e o PEDF, respetivamente. Com base nestes dados, este trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de expressão do transportador GLUT1 e dos fatores VEGF e PEDF em sistemas in vitro de células da retina D407 em condições de hipóxia e normóxia sujeitas a diferentes concentrações de glucose. Foi ainda avaliada a expressão do GLUT1 e dos fatores VEGF e PEDF in vivo, em amostras de retina de ratinhos Ins2Akita, um modelo animal de DM tipo I, que apresenta algumas características da DR, e em amostras de animais “wild type” não diabéticos. Esta avaliação foi feita ainda em dois momentos na vida dos ratinhos: aos 6 meses de idade, que representa o início do desenvolvimento da doença em que começa a mostrar alguns sintomas característicos de DR, como microaneurismas e vazamento vascular, e aos 12 meses de idade, que representa um estádio crónico da doença. Os resultados mostram in vitro, nas células RPE imortalizadas D407 um aumento do transportador GLUT1 quando estas são sujeitas a condições de hiperglicemia e hipóxia. Mas o que se destacou foi o facto de este aumento ser mais predominante nas membranas das células o que sugere que há um aumento não só da concentração como também da sua translocação para a membrana celular. Em relação aos níveis de expressão do PEDF in vitro apesar de esta diminuição não ser significativa, apresenta tendência para diminuir em condições de hipóxia. Contudo, nos níveis de expressão do VEGF in vitro não se verificou qualquer alteração nas condições testadas. Nos resultados in vivo podemos verificar que houve um aumento da expressão do transportador GLUT1 na retina de ratinhos Ins2Akita em comparação com os ratinhos “wild type” de 6 meses de idade, sugerindo que este aumento dos transportadores poderá estar associado ao desenvolvimento de DR em estádios precoces da doença. Já aos 12 meses este aumento não é significativo o que poderá estar associado à senescência que a retina apresenta nesta idade. Em relação ao PEDF in vivo, podemos constatar que em amostras de retina e de epitélio pigmentar da retina (RPE) de ratinhos de 6 meses houve uma diminuição significativa na sua expressão aos 6 meses de idade. Já aos 12 meses essa expressão foi abolida na RPE dos ratinhos diabéticos. Por último, os níveis de expressão do VEGF in vivo são controversos pois podemos verificar um aumento da expressão do mRNA nas retinas dos ratinhos Ins2Akita, aos 6 meses de idade, mas não da proteína. Porém, aos 12 meses não se verificou alteração dos níveis de mRNA entre estirpes mas sim uma diminuição da expressão proteica que pode estar associado ao estádio avançado da doença nos ratinhos Ins2Akita. O nosso estudo sugere que o GLUT1 e o PEDF podem ser componentes importantes para o desenvolvimento de DR, sendo este último mais importante no estádio inicial da doença.