Identification of novel molecular determinants of tissue mineralization in fish

The identification of genes involved in signaling and regulatory pathways, and matrix formation is paramount to the better understanding of the complex mechanisms of bone formation and mineralization, and critical to the successful development of therapies for human skeletal disorders. To achieve this objective, in vitro cell systems derived from skeletal tissues and able to mineralize their extracellular matrix have been used to identify genes differentially expressed during mineralization and possibly new markers of bone and cartilage homeostasis. Using cell systems of fish origin and techniques such as suppression subtractive hybridization and microarray hybridization, three genes never associated with mechanisms of calcification were identified: the calcium binding protein S100-like, the short-chain dehydrogenase/reductase sdr-like and the betaine homocysteine S-methyltransferase bhmt3. Analysis of the spatial-temporal expression of these 3 genes by qPCR and in situ hybridization revealed: (1) the up-regulation of sdr-like transcript during in vitro mineralization of gilthead seabream cell lines and its specificity for calcified tissues and differentiating osteoblasts; (2) the up-regulation of S100-like and the down-regulation of bhmt3 during in vitro mineralization and the central role of both genes in cartilaginous tissues undergoing endo/perichondral mineralization in juvenile fish. While expression of S100-like and bhmt3 was restricted to calcified tissues, sdr-like transcript was also detected in soft tissues, in particular in tissues of the gastrointestinal tract. Functional analysis of gene promoters revealed the transcriptional regulation of the 3 genes by known regulators of osteoblast and chondrocyte differentiation/mineralization: RUNX2 and RAR (sdr-like), ETS1 (s100-like; bhmt3), SP1 and MEF2c (bhmt3). The evolutionary relationship of the different orthologs and paralogs identified within the scope of this work was also inferred from taxonomic and phylogenetic analyses and revealed novel protein subfamilies (S100-like and Sdr-like) and the explosive diversity of Bhmt family in particular fish groups (Neoteleostei). Altogether our results contribute with new data on SDR, S100 and BHMT proteins, evidencing for the first time the role for these three proteins in mechanisms of mineralization in fish and emphasized their potential as markers of mineralizing cartilage and bone in developing fish.

Nos vertebrados, o sistema esquelético representa uma das mais importantes inovações ocorridas durante a evolução, estando na base de múltiplos mecanismos de adaptação. É o sistema responsável pelo suporte e proteção dos órgãos vitais, pela locomoção (através da interação com músculos, tendões e ligamentos), permite o armazenamento e balanço homeostático de minerais, a produção de fatores de crescimento e, nos mamíferos, funciona ainda como o principal órgão hematopoiético. O esqueleto dos vertebrados é maioritariamente composto por dois tipos distintos de tecidos conectivos, o osso e a cartilagem, que diferem não só nos tipos celulares que os constituem mas também na composição da sua matriz extracelular, nos tipos de vascularização e nas propriedades químicas e físicas. O esqueleto é assim um sistema bastante complexo, rigorosamente regulado por várias vias de sinalização e inúmeros fatores que ditam diversas decisões celulares para um desenvolvimento coordenado. Tal como noutros sistemas, a desregulação de um ou mais fatores moleculares leva ao aparecimento de patologias, como por exemplo a osteoporose, diferentes tipos de escolioses, osteoartrites e tumores. Apesar do sistema ósseo ser já bastante estudado, existem ainda vários intervenientes pouco caracterizados, e outros ainda desconhecidos, o que resulta numa falta de terapêutica adequada a algumas doenças. Assim, é essencial conhecer melhor os mecanismos fisiológicos (e patológicos) do osso, bem como as suas vias de sinalização e regulação e respetivos genes associados. Durante muitos anos, o estudo do osso e da cartilagem teve como modelo preferencial os mamíferos, no entanto, mais recentemente, o peixe mostrou ter inúmeras vantagens, sendo hoje reconhecido pela comunidade científica como um modelo biológico para o estudo da esqueletogénese. A sua grande progenia, o desenvolvimento externo e estados larvares translúcidos são apenas algumas das vantagens do peixe como modelo que, apesar das diferenças que possui relativamente aos mamíferos como consequência da evolução, tem ainda uma conservação marcante a nível genético. Os peixes possuem não só genes ortólogos para a grande maioria dos genes de mamíferos, como também os mecanismos moleculares são preservados, tendo-se tornado num modelo emergente quer para o desenvolvimento quer para estudos genéticos e funcionais. Apesar do uso preferencial do peixe enquanto modelo biológico recair sobre o peixe zebra (Danio rerio), dadas as diversas vantagens a ele associadas, este não é o único modelo reconhecido. Um exemplo é o caso da dourada (Sparus aurata), um teleósteo marinho com uma importância económica muito relevante na indústria piscícola, e que tem sido largamente utilizado na investigação do osso, uma vez que o seu cultivo em larga escala leva ao desenvolvimento de deformações esqueléticas. Na última década, têm sido desenvolvidas várias ferramentas laboratoriais para melhor estudar este modelo, quer a nível genético (construção de bibliotecas de DNA, microarrays, caracterização funcional de genes) quer a nível de culturas in vitro (linhas celulares com capacidade de mineralização; derivadas do osso, VSa16, e da cartilagem, VSa13). Em particular, estas linhas celulares (VSa13 e VSa16) permitiram também a utilização de técnicas, como a hibridização subtrativa supressiva (HSS) e microarrays, ferramentas moleculares que permitem evidenciam genes diferencialmente expressos em diferentes condições. Com base nestas técnicas, tem sido possível a identificação de novos genes marcadores do desenvolvimento dos componentes do esqueleto. Estudos anteriores permitiram a identificação de genes ortólogos de várias proteínas em dourada (p.ex.: mgp, oc, fhl2, bmp2), sendo possível estudar a sua expressão durante o processo de diferenciação celular e mineralização in vitro, não só confirmando a conservação das funções já descritas para mamíferos no peixe, mas também validando a dourada como modelo biológico. Este trabalho pretende assim, caracterizar genes ainda não descritos para a dourada e com uma potencial função no processo de mineralização. A descoberta de novos genes potencialmente envolvidos neste processo partiu de um grupo de genes diferencialmente expressos durante o processo de mineralização extracelular das células VSa16 e Vsa13 identificados pelos métodos acima descritos (HSS e microarray). De entre esses genes, três suscitaram particular interesse pelas consideráveis diferenças de expressão dos seus transcritos no processo de mineralização: a proteína de ligação de cálcio S100 – S100-like, a desidrogenase/reductase de cadeia curta - sdr-like – e a betaína-homocisteína metil-transferase – posteriormente designada de bhmt3. Uma vez que a função destes 3 genes durante a mineralização extracelular permanece por caracterizar, e dois deles (sdr-like e bhmt3) nunca haviam sido antes associados a mecanismos celulares do osso e da cartilagem, este trabalho tem como principal objetivo o estudo e a caracterização das suas funções em processos de mineralização/esqueletogénese. A caracterização molecular destes genes envolveu: 1) o estudo da expressão de cada gene em tecidos e durante os diferentes estádios de desenvolvimento da dourada, através de técnicas de PCR em tempo real (ou northern blot para S100-like) e hibridação in situ; 2) o estudo da sua regulação transcricional, focado em fatores de transcrição associados aos processos de diferenciação do osso e da cartilagem, com recurso à transfecção de células, e 3) o conhecimento da sua evolução filogenética e taxonómica, através de técnicas bioinformáticas. A expressão genética espacial e temporal revelou que enquanto os genes s100-like e bhmt3, são altamente específicos de tecidos cartilagíneos em processo de mineralização, o gene de sdr-like, é encontrado em tecidos pré-calcificados com associação à diferenciação de osteoblastos. Estes resultados sugerem assim uma função no esqueleto para os 3 genes. No entanto, se os dois primeiros são genes altamente específicos de tecidos em processo de mineralização, a expressão do gene sdr-like em tecidos moles, em particular nos tecidos associados ao trato gastrointestinal, pressupõe uma função não restrita aos processos de desenvolvimento do esqueleto. Com base na sua expressão, propomos que os genes s100-like e bhmt3 são marcadores da ossificação endocondral em dourada, podendo ser utilizados em estudos posteriores de caracterização dos processos de diferenciação da cartilagem. Relativamente ao estudo da regulação transcricional, a nossa análise revelou que os 3 genes parecem ser regulados por fatores de transcrição com um papel importante na diferenciação de células do osso (osteoblastos) e/ou da cartilagem (condrócitos): RAR e Runx2 (sdr-like); ETS1 (S100-like e bhmt3); SP1 e MEF2c (bhmt3), confirmando mais uma vez a sua possível função na esqueletogénese. Por fim, a relação evolucionária dos diferentes ortólogos e parálogos aqui identificados, revelou novas subfamílias proteicas para S100-like e Sdr-like, as quais parecem não ter membros em mamíferos, e uma explosão de diversidade de genes Bhmt para o grupo específico de peixes Neoteleósteos, com até pelo menos seis isoformas identificadas para esta proteína. Ao longo deste trabalho foram recolhidos novos dados que contribuíram para uma melhor caracterização das proteínas S100, SDR e BHMT, tendo sido evidenciado pela primeira vez novas funções para as duas últimas no processo de mineralização. Foi ainda demonstrado que a existência de mais do que uma isoforma para as proteínas BHMT não é exclusiva de mamíferos como até aqui se pressuponha. Finalmente, no seu conjunto os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para a validação dos peixes como um modelo alternativo, em particular da dourada e suas ferramentas, na investigação de mecanismos moleculares envolvidos em processos de mineralização dos tecidos.