Effects of mixture of nanoparticles under different salinity in the clams Ruditapes philippinarum and Ruditapes decussatus

Dissertação de mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidadde do Algarve, 2015

Few studies have been done to determine the toxicity of Nanoparticles (NPs) on marine ecosystems and its effect on the biota. NPs interaction with Salinity, a major environmental factor, needs particular attention. Organisms in the Venice lagoon, the sampling site of this study, are subject to a wide range of salinity, yet little is known about the combined effect of an environmental stressor and NPs. Thus, this work aimed to evaluate the toxicological effects of salinity/NPs interaction. The study was conducted in two species: R. decussatus, native clams from the lagoon, and R. philippinarum, a clam deliberately introduced that has supplanted the native species. The two clams were exposed for 7 days to nZnO, nTiO2 and fullerene C60 (1 μg/L), at three salinity levels (18, 28, 38), with tissue collections after 1, 3 and 7 days. Biomarkers were evaluated in hemolymph, gills and digestive gland; RNA/DNA ratio and proteins were measured in foot tissue. R. decussatus had a significant increase in micronuclei, nuclear abnormalities, CAT and SOD at higher salinity, whereas LDH and NRU showed significant increases at low salinity. GST showed PCC showed increases at high salinity. RNA/DNA ratio did not show significant differences and the proteins presented significant decreases in medium and high salinity. R. philippinarum showed significant differences in micronuclei and nuclear abnormalities at high salinity and LDH and NRU with differences at lower salinity. CAT showed different values at low and high; SOD showed differences in the higher salinities. GST, LPO and PCC levels showed differences in the lower salinities. RNA/DNA ratio and proteins presented no differences. The results support the premise that R. decussatus is less resistant than the invasive species. This work is among the first to try to determine if the combination salinity/NPs have a synergistic effect on aquatic organisms.

Os impatos antropogénicos nos ecossistemas marinhos são cada vez maiores, entre eles destacam-se os associados á alteração na qualidade e quantidade das águas de drenagem continental. Ao nível da qualidade da água, as atividades industriais em crescimento, como as associadas á nanotecnologia, responsáveis pela criação e manipulação de materiais dentro da nanoescala, têm consequências para o biota que vive nestes meios. As propriedades físicas e químicas das nanopartículas (NPs) diferenciam-se substancialmente da forma bruta desse mesmo material, e permitem uma crescente aplicação em diversos setores industriais e comerciais como a medicina, farmácia, cosmética, produção de energia, eletrónica e ambiente. O crescente desenvolvimento desta indústria é tal que se espera uma produção de 58000 toneladas de NPs até ao ano 2020. Com este número exorbitante de produção é inevitável que muitas NPs cheguem ao ambiente e aos ecossistemas aquáticos, levando a uma interação com o biota. Devido às inúmeras fontes de NPs (fábricas, uso de produtos, processos de combustão, etc…) é ainda impossível determinar exatamente a quantidade de NPs que pode ser encontrada no ambiente. Para ultrapassar a falta de informação quantitativa das NPs estimações obtidas por modelação são usadas em estudos. Contudo é imperativo o desenvolvimento de métodos para contabilizar e caracterizar as NPs para uma melhor avaliação de risco do ambiente. Poucos estudos foram feitos ainda para averiguar a toxicidade destas NPs, pois o que torna as NPs tão desejadas, como as diferentes propriedades que têm quando são reduzidas à nanoescala, também as tornam imprevisíveis quando em contacto com o ambiente e o biota. Com uma grande concentração a entrar nos ecossistemas a informação do efeito da interação destas com o biota é ainda escasso. Por outro lado, a variação da quantidade de água doce que atinge estas zonas de transição, associado às atividades antropogénicas interfere também com as comunidades. A salinidade é um importante fator ambiental que caracteriza um corpo de água, tem efeitos nos processos fisiológicos, como sobrevivência, conteúdo de água dos tecidos e tem outros efeitos subletais. Na lagoa de Veneza, o local de amostragem deste estudo, a variação é grande. Esta variação ocorre durante o ano mas também dentro da lagoa a salinidade diverge entre áreas. Por esta razão os organismos aquáticos ficam sujeitos a vários níveis de salinidade. A lagoa está atualmente bastante poluída, com contaminações vindas das diversas áreas industriais. Ruditapes decussatus, amêijoa nativa da lagoa de Veneza, foi quase completamente substituída pela espécie Ruditapes philippinarum, que foi introduzida propositadamente numa altura em que a produção de organismos nativos estava irregular. Agora R. decussatus ocupa espaços bastante restritos e com densidades mais baixas que a espécie invasora. Poucos estudos foram feitos para averiguar o efeito combinado de fatores de stress ambiental com as NPs. Com as alterações globais é necessário averiguar o potencial efeito que a diferença nos fatores ambientais terá nos organismos e subsequentemente no ecossistema. Deste modo, esta dissertação teve como objetivo avaliar os efeitos toxicológicos da combinação de diferentes níveis de salinidade com uma mistura de NPs. Este estudo foi realizado em duas espécies de amêijoa, R. decussatus e R. philippinarum, uma nativa e outra invasora, para determinar se algum efeito sinergético ocorre e se existe alguma diferença de sensibilidades entre elas. Para compreender se algum efeito combinado existe, as duas amêijoas foram expostas a concentrações ambientalmente relevantes (1μg/L) de nZnO, nTiO2 e fulereno C60, a três níveis de salinidade: 18, 28 e 38. As amêijoas foram mantidas em tanques de vidro de 35 L, alimentadas diariamente e com mudas de água e fornecimento de NPs diárias. Para cada nível de salinidade havia um controlo, ou seja sem fornecimento de NPs, e cada tanque teve uma réplica. A exposição durou 7 dias mas recolhas de tecidos foram feitas depois de 1, 3 e 7 dias de exposição. Foi utilizada uma bateria de biomarcadores na hemolinfa, brânquias e glândula digestiva das amêijoas, nomeadamente biomarcadores de stress oxidativo (enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa S-transferase, peroxidação lipídica e conteúdo de proteína carbonilada), de citotoxicidade (lactato desidrogenase e capacidade pinocitótica) e de genotoxicidade (micronúcleo e aberrações nucleares). Para determinar a condição fisiológica das amêijoas também o conteúdo de RNA, DNA e conteúdo de proteínas foi determinado, em tecido do pé. R. decussatus apresentou aumento significativo em micronúcleos e aberrações nuclear na maior salinidade. Já a enzima LDH e capacidade pinocitótica apresentaram aumentos significativos a baixa salinidade. Nos biomarcadores de stress oxidativo CAT e SOD apresentaram valores altos nas salinidades mais altas, enquanto GST apresentou valores não muito claros. Os níveis de peroxidação lipídica apresentaram diferenças na salinidade mais baixa e mais alta, e proteínas carboniladas com aumentos na salinidade alta. No rácio RNA/DNA R. decussatus apresentou valores mais baixos em salinidades mais altas, mas as diferenças não eram significativas. O conteúdo proteico apresentou decréscimos significativos nas salinidades média e alta. R. philippinarum apresentou aumentos significativos de micronúcleos e aberrações nucleares na salinidade alta, e citotoxicidade alta na salinidade mais baixa. As enzimas antioxidantes mostraram resultados muito diferentes entre enzimas e tecidos. CAT mostrou valores diferentes a salinidade baixa e alta, SOD apresentou diferenças nas salinidades mais altas e GST apresentou diferenças nas salinidades mais baixas. Os níveis de peroxidação lipídica apresentaram diferenças nas salinidades mais baixas e proteínas carboniladas com diferenças nas salinidades mais baixas mas com retorno aos níveis controlo no fim da exposição. O rácio RNA/DNA e o conteúdo proteico não apresentaram diferenças significativas. R. decussatus mostrou resultados consistentes, com maior dano a ser revelados na maior salinidade. R. philippinarum não demonstrou um padrão claro, sugerindo que o efeito depende do biomarcador avaliado e do tecido analisado. Após sete dias de exposição, R. decussatus mostrou estar mais fisiologicamente debilitada, em relação á amêijoa invasiva. Os resultados parecem corroborar a premissa que R. decussatus é menos resistente que a invasiva R. philippinarum. É importante salientar que este trabalho é um dos primeiros a tentar determinar se a combinação salinidade/NPs tem um efeito sinergético nos organismos aquáticos. Com as alterações que estão a ocorrer no ambiente é importante aprofundar esta questão para uma melhor preparação e prevenção.