Evaluation of the protective effect of Phlomis purpurea against Phytophthora cinnamomi in Fagaceae and of root metabolites involved

Tese de doutoramento, Ciências Agrárias (Proteção de Plantas), Faculdade de Ciência e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Phytophthora cinnamomi Rands devastates natural ecosystems and crops around the world causing enormous economic losses. The “montado” ecosystem is threatened by this highly aggressive pathogen. Much concern involving fungicide use highlighted the need to develop new environmentally friendly means of control. In this work, Phlomis purpurea L., which was recently reported to have activity against P. cinnamomi and protect susceptible Quercus ilex and Q. suber from infection, was further studied. To determine the protective activity of P. purpurea on the infection of susceptible species a greenhouse assay was implemented showing that, when planted next to the host, it was able to significantly reduce the average severity of host’s root symptoms. A field assay was set on naturally infested plots to determine the protective effect of this herbaceous plant towards Q. suber. P. purpurea significantly increased the emergence and survival of Q. suber. In both assays P. purpurea planted alone was able to completely eliminate P. cinnamomi. In order to study the effectiveness of P. purpurea root extracts (PRE) to control Q. suber and Q. ilex root infection by this oomycete, in vivo assays were set up. PRE at 10 mg ml-1 significantly inhibited P. cinnamomi zoospore infection of both plants. Moreover, PRE was able to elicit a defence response on Q. suber roots. To identify the active principle, bioactivity guided isolation was performed after fractionation of PRE. Isolation, purification and structural characterization led to identification of a novel nortriterpene, phlomispurpentaolone, containing the anti-P. cinnamomi activity. Moreover, P. purpurea metabolites produced constitutively and upon challenge with P. cinnamomi were quantified using LC-MS showing that phlomispurpentaolone is a phytoanticipin. Another goal was to confirm the resistance of P. purpurea to P. cinnamomi by histological techniques. P. purpurea roots were shown to have a constitutive strengthened exodermis that can act, per se, as a physical barrier for the penetration of P. cinnamomi.

Phytophthora cinnamomi Rands é um oomiceta que, tendo uma vasta gama de hospedeiros devasta ecossistemas naturais e culturas em todo mundo, causando enormes prejuízos económicos. O "montado" é um ecossistema agro-silvo-pastoril de alto valor socioeconómico, composto principalmente por sobreiros (Quercus suber) e azinheiras (Quercus ilex subsp. rotundifolia) que estão a ser dizimados por este agente patogénico. O sobreiro reveste-se de particular importância visto que é a árvore de onde se extrai a cortiça. Portugal é o primeiro produtor e exportador de cortiça mas essa posição está em risco dado que os sobreiros estão a ser substituídos por outras árvores mais resistentes a P. cinnamomi. Sendo um agente patogénico do solo dotado de grande capacidade de sobrevivência P. cinnamomi é extremamente difícil de erradicar, incluíndo o uso dos fungicidas. A grande preocupação, quer ambiental quer para a saúde, que envolve o uso de fungicidas levou à necessidade de se desenvolverem novos meios ecológicos de controlo. A marioila (Phlomis purpurea L.) é uma herbácea, da família Lamiaceae, espontânea em habitats de Quercus suber e Q. ilex subsp. rotundifolia no sul de Portugal que cresce, sem manifestar sinais de doença, em áreas afetadas pela doença declínio. Recentemente, foi por nós publicado que o extrato de raízes de Phlomis purpurea (PRE) inibe significativamente a produção de todas as estruturas de ciclo da doença bem como a germinação de clamidósporos e de zoósporos. Também foi demonstrado em ensaios de estufa que P. purpurea reduz o potencial do inóculo no solo, o que se traduz na capacidade de reduzir a infeção de outras plantas, sugerindo que P. purpurea tem potencial para evitar a disseminação da doença. Esta planta é resistente à infeção por este agente patogénico. Neste trabalho, foram realizados ensaios de estufa para determinar a atividade protetora de P. purpurea na infeção de Quercus canariensis, Q. coccifera e Castanea sativa quando é co-plantada com cada uma delas num mesmo vaso. P. purpurea reduziu significativamente a severidade média dos sintomas radiculares das plantas hospedeiras. Foi, também, efetuado um ensaio de campo em parcelas naturalmente infestadas com P. cinnamomi para determinar o efeito protetor desta planta em Q. suber. Em duas parcelas foram semeadas landes de sobreiro e em outras duas parcelas landes de sobreiro juntamente com P. purpurea. Esta planta aumentou significativamente a germinação e consequentemente a emergência e a sobrevivência de Q. suber. Em ambos os ensaios P. purpurea isolada foi, por si só, capaz de eliminar completamente o inóculo de P. cinnamomi presente no solo à volta das raízes. De modo a estudar a eficácia do PRE no controlo da infeção das raízes de Q. suber e Q. ilex por parte deste oomiceta, foram realizados ensaios in vivo. O PRE, à concentração de 10 mg ml-1, inibiu significativamente (84.1%) a infeção pelos zoósporos de P. cinnamomi em ambas as plantas, não sendo as raízes de Q. ilex sequer infetadas. Além disso, o PRE foi capaz de provocar uma resposta de defesa nas raízes de Q. suber, como revelado pela redução significativa da proporção de raízes infetadas. Outro objetivo foi estudar a interacção de P. purpurea com P. cinnamomi utilizando técnicas histológicas. As raízes de P. purpurea infestadas com zoósporos e micélio, após 72 h, não apresentaram sinais de infeção. Também não apresentaram alterações histológicas. Algumas poucas hifas foram detetadas na superfície da epiderme mas não conseguiram penetrar na raiz. As raízes de marioila mostraram ter uma epiderme reforçada, com lignina e taninos, e uma exoderme, composta por celulose e suberina, que pode atuar, por si, como uma barreira física impedindo a penetração de P. cinnamomi. Por outro lado, infestou-se Q. suber (uma espécie susceptível) com micélio e zoósporos. Após 16-24 h as raízes começaram a mostrar sinais de infeção e após 72 h apresentavam necroses extensas. Após 48 h eram visíveis, microscopicamente, danos nos tecidos e distorção da parede celular com proliferação das hifas tanto inter como intra-celularmente, através da epiderme, do parênquima cortical e cilindro vascular. Porém, as raízes eliciadas com PRE, 24 h antes da infestação com o agente patogénico, apresentavam células epidérmicas e hipodérmicas irregulares com paredes espessas pela deposição de lignina e taninos e, 48 h após a infestação com micélio e zoósporos, as hifas apresentavam-se restritas principalmente aos espaços intercelulares da epiderme, com pequenas incursões no córtex mas não alcançaram o cilindro vascular. Além disso, as raízes de Q. suber expostas simultaneamente a PRE e zoósporos, não mostraram lesões macroscópicas após 48 horas e, também não foi observada penetração nos tecidos ao microscópio. Provavelmente, esta proteção foi causada pela atividade antagónica direta do PRE sobre os zoósporos como mostrado previamente in vitro. Um dos objetivos deste estudo foi, ainda, identificar uma substância, eventualmente, responsável pela inibição de P. cinnamomi. O PRE foi analisado por HPLC-ESI/MS/MS. As frações de HPLC foram recuperadas e a sua actividade anti-P. cinnamomi determinada. A fração com maior atividade revelou a presença de um composto principal com m/z 490,4 (M+H)+, que inibiu completamente o crescimento de micélio de P. cinnamomi a uma concentração de 0,5 mg ml-1. Este composto foi isolado a partir de PRE por cromatografia preparativa em sílica gel com uma pureza de ca 90 % e foi purificado por recristalização Este é um novo nortriterpenoide estruturalmente caracterizado por ressonância magnética nuclear (RMN) 1D e 2D, espectrometria de massa por ionização por electropulverização (ESI/MS), espectroscopia de infravermelho (IR) e difração de raios-X (XRD). Este composto foi denominado phlomispurpentaolone. A uma concentração de 0,1 mgml-1, phlomispurpentaolone inibiu 75,7 % do crescimento do micélio de P. cinnamomi, cerca de 100 vezes mais do que o PRE. Com a finalidade de descobrir outros metabolitos que são potencialmente bioativos contra P. cinnamomi, plântulas de P. purpurea foram inoculadas com zoósporos em 6 tempos (0, 6, 12, 24, 48 e 72 h). Foram, também, preparados controlos e exsudatos das mesmas plantas nos mesmos intervalos de tempo. O material a partir das plantas em cada intervalo de tempo foi reunido (11 x 5 repetições). As raízes e as folhas foram extraídas com MeOH. Lípidos e metabolitos ligeiramente polares foram separados utilizando cromatografia de fase reversa (RPC) com HSS T3 C18. Os exsudados também foram recolhidos e esterilizados por filtração a cada intervalo de tempo, imediatamente submersos em azoto líquido e mantidos a -80 °C. Os metabolitos de P. purpurea produzidos, tanto constitutivamente como após infestação com P. cinnamomi, foram quantificados utilizando um sistema de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (UPLC-MS). Os exsudatos das raízes foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) após derivatização. Verificou-se que phlomispurpentaolone é produzido constitutivamente. Este trabalho de investigação contribuiu para elucidar os mecanismos de defesa de P. purpurea contra P. cinnamomi bem como o principal composto produzido por esta planta com atividade contra este agente patogénico. A capacidade de erradicar este agente patogénico utilizando uma planta autóctone abre novas perspectivas para o controlo do declínio do sobreiro bem como de outras espécies hospedeiras deste oomiceta.