Molecular characterization of Gla-rich protein (GRP) gene expression and function

Gla-rich protein (GRP) is a vitamin K-dependent protein related to bone and cartilage recently described. This protein is characterized by a large number of Gla (γ-carboxyglutamic acid) residues being the protein with the highest Gla content of any known protein. It was found in a widely variety of tissues but highest levels was found in skeletal and cartilaginous tissues. This small secreted protein was also expressed and accumulated in soft tissues and it was clearly associated with calcification pathologies in the same tissues. Although the biological importance of GRP remains to be elucidated, it was suggested a physiological role in cartilage development and calcification process during vertebrate skeleton formation. Using zebrafish, an accepted model to study skeletal development, we have described two grp paralog genes, grp1 and grp2, which exhibited distinct patterns of expression, suggesting different regulatory pathways for each gene. Gene synteny analysis showed that grp2 gene is more closely related to tetrapod grp, although grp1 gene was proposed to be the vertebrate ortholog by sequence comparison. In addition, we identified a functional promoter of grp2 gene and using a functional approach we confirmed the involvement of transcription factors from Sox family (Sox9b and Sox10) in the regulation of grp2 expression. In an effort to provide more information about the function of grp isoforms, we generated two zebrafish transgenic lines capable to overexpress conditionally grp genes and possible roles in the skeleton development were studied. To better understand GRP function a mammalian system was used and the analysis of knockout mice showed that GRP is involved in chondrocyte maturation and the absence of GRP is associated to proteoglycans loss in calcified articular cartilage. In addition, we detected differences in chondrogenesis markers in articular chondrocyte primary culture. Overall, our data suggest a main role for GRP on chondrocyte differentiation.

O gene da proteína rica em Gla (GRP; Gla-rich protein) codifica para a mais recente proteína dependente da vitamina K relacionada com osso e cartilagem descrita até ao momento. Esta proteína é caracterizada por um elevado número de resíduos Gla (ácido glutâmico γ-carboxilado), sendo esta proteína a que possui o maior teor de Gla conhecido até à data. Além disso, a GRP mantém as características específicas comuns a outras proteínas dependentes de vitamina K, tais como um local de reconhecimento da γ-glutamil carboxilase, um local de clivagem proteolítica e um domínio Gla na proteína madura. A expressão da GRP foi detetada numa ampla variedade de tecidos tendo sido os níveis mais elevados encontrados em tecidos esqueléticos e cartilaginosos. Esta pequena proteína secretada encontra-se expressa e é acumulada em tecidos moles e foi claramente associada com patologias de calcificação nestes mesmos tecidos. Além do transcrito original da GRP, seis transcritos alternativos foram descritos e caracterizados pela ausência de elementos importantes nesta proteína, sendo estes o péptido de sinal, o local de reconhecimento γ-glutamil carboxilase e / ou grande parte do domínio Gla. A perda destes elementos alteram a secreção e / ou carboxilação da GRP. No entanto, a importância biológica dos transcritos da GRP continua por ser elucidado. A função molecular ainda é desconhecida, mas foi sugerido um papel fisiológico no desenvolvimento da cartilagem e do processo de calcificação durante a formação do esqueleto dos vertebrados. O peixe-zebra tornou-se num organismo modelo muito utilizado sendo também cientificamente aceite como um organismo modelo para estudar o desenvolvimento do esqueleto e os mecanismos de calcificação óssea. Usando o peixe-zebra como modelo animal, nós descrevemos dois genes parálogos do gene da GRP, grp1 e grp2. Estes dois genes apresentam padrões distintos de expressão, o que sugere diferentes vias de regulação para cada gene. Enquanto a grp1 foi detetada com níveis elevados logo no início do desenvolvimento embrionário, a expressão da grp2 aparece mais tarde no desenvolvimento embrionário e com níveis inferiores aos verificados para a grp1, mas aumenta nos estádios larvares e juvenis, mantendo-se como o parálogo mais preponderante em tecidos adultos. Apesar de possuírem padrões de expressão distintos durante o desenvolvimento embrionário, o mesmo não se verifica no padrão tecidular. Ambos os parálogos, grp1 e grp2, são expressos em todos os tecidos testados com níveis de expressão mais elevados em tecidos ósseos e cartilagíneos. O gene grp1 foi proposto como o gene ortólogo dos vertebrados, através da comparação de sequências. No entanto, através de uma análise de sintenia, o estudo mostrou que o gene grp2 é que se encontra evolutivamente mais próximo do gene grp de tetrápodes. Isto deve-se ao facto da maioria dos genes que fazem fronteira com o gene grp2 em peixe-zebra, se encontrarem conservados noutras espécies. Dado que o gene grp2 foi, num contexto genómico, considerado o gene ortólogo e a informação disponível sobre a regulação do gene da GRP é escassa, resolveu-se estudar a regulação do gene grp2. Neste estudo, foi identificado um promotor funcional do gene grp2 em peixe-zebra através de ensaios in vitro e in vivo. A análise in silico da região promotora de gene identificou vários possíveis locais de ligação a fatores de transcrição conhecidos por regularem genes relacionados com osso e cartilagem tais como os fatores de transcrição da família Sox, Mef2 e Ets. Os resultados in vitro demonstraram que os fatores de transcrição Sox9b, Sox10, Mef2ca e Ets1a regulam positivamente a transcrição do gene grp2. No entanto, a partir de uma abordagem funcional apenas os fatores de transcrição Sox9b e Sox10 parecem regular a expressão do gene grp2. Tendo em conta os níveis de conservação entre o gene grp2 do peixe-zebra (que é o ortólogo do gene humano) e o gene GRP humano, é provável que estes fatores de transcrição possam ser relevantes na regulação do gene GRP humano. Num esforço para se obter mais informações sobre a função das isoformas da Grp em peixe-zebra, duas linhagens transgénicas de peixe-zebra capazes de sobre-expressar condicionalmente a Grp foram desenvolvidas. Até ao momento apenas uma das linhas transgénicas se encontra estabelecida, a que sobre-expressa a isoforma Grp1. No estudo preliminar realizado, em que a Grp1 foi sobre-expressa no início de desenvolvimento embrionário, não se verificou nenhuma alteração, a nível estrutural/histológico no desenvolvimento do esqueleto. No entanto, otimizações /alterações ao procedimento experimental deverão ser realizadas. De modo a entender melhor a função da GRP e devido aos resultados contraditórios observados em modelos animais distintos, foram analisados ratinhos knockout para o gene Grp. Apesar dos animais não apresentarem um fenótipo visível, a análise histológica das placas de crescimento demostrou que a GRP está envolvida na maturação dos condrócitos, uma vez que ratinhos knockout para o gene Grp possuem uma zona de condrócitos hipertróficos maior do que os ratinhos wild type. Além disso, os ratinhos knockout para o gene Grp apresentam um maior comprimento do fémur em relação ao dos ratinhos wild type. Além disso, a ausência da GRP está associada à perda de proteoglicanos na cartilagem articular calcificada, tendo sido este resultado verificado em diferentes idades, dos 6 aos 18 meses de vida. De modo a verificar a função da GRP na osteoartrose, doença degenerativa da cartilagem hialina, ratinhos knockout submetidos à remoção do menisco para o gene Grp foram submetidos cirurgicamente à remoção do menisco. A meniscectomia permite desenvolver a osteoartrose. Contudo, não foram observadas quaisquer diferenças histológicas significativas entre os ratinhos wild type e knockout para o gene Grp. A GRP foi utilizada noutros trabalhos como marcador genético para a identificação de condrócitos. Neste trabalho, obtivemos condrócitos imaturos articulares de ratinhos wild type e ratinhos knockout para o gene Grp. Estas culturas primárias de condrócitos articulares foram posteriormente analisadas através de PCR quantitativo e demonstraram diferenças na expressão de outros marcadores de condrogénese, entre os quais o colagénio tipo 2α1, SOX9, agrecan, osteonectina, BMP4 e MGP. Num modo geral, este trabalho permitiu demonstrar a importância da GRP no processo de condrogénese mais especificamente na diferenciação dos condrócitos.

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