Insights into molecular and cellular events involved in normal and pathological vertebral development and fusion using zebrafish as model organism

The vertebral column and its units, the vertebrae, are fundamental features, characteristic of all vertebrates. Developmental segregation of the vertebral bodies as articulated units is an intrinsic requirement to guarantee the proper function of the spine. Whenever these units become fused either during development or postsegmentation, movement is affected in a more or less severe manner, depending on the number of vertebrae affected. Nevertheless, fusion may occur as part of regular development and as a physiological requirement, like in the tetrapod sacrum or in fish posterior vertebrae forming the urostyle. In order to meet the main objective of this PhD project, which aimed to better understand the molecular and cellular events underlying vertebral fusion under physiological and pathological conditions, a detailed characterization of the vertebral fusion occurring in zebrafish caudal fin region was conducted. This showed that fusion in the caudal fin region comprised 5 vertebral bodies, from which, only fusion between [PU1++U1] and ural2 [U2+] was still traceable during development. This involved bone deposition around the notochord sheath while fusion within the remaining vertebral bodies occur at the level of the notochord sheath, as during the early establishment of the vertebral bodies. A comparison approach between the caudal fin vertebrae and the remaining vertebral column showed conserved features such as the presence of mineralization related proteins as Osteocalcin were identified throughout the vertebral column, independently on the mineralization patterns. This unexpected presence of Osteocalcin in notochord sheath, here identified as Oc1, suggested that this gene, opposing to Oc2, generally associated with bone formation and mature osteoblast activity, is potentially associated with early mineralization events including chordacentrum formation. Nevertheless, major differences between caudal fin region and anterior vertebral bodies considering arch histology and mineralization patterns, led us to use RA as an inductive factor for vertebral fusion, allowing a direct comparison of equivalent structures under normal and fusion events. This fusion phenotype was associated with notochord sheath ectopic mineralization instead of ectopic perichordal bone formation related with increased osteoblast activity, as suggested in previous reports. Additionally, alterations in ECM content, cell adhesion and blood coagulation were discussed as potentially related with the fusion phenotype. Finally, Matrix gla protein, upregulated upon RA treatment and shown to be associated with chordacentrum mineralization sites in regular development, was further described considering its potential function in vertebral formation and pathological fusion. Therefore with this work we propose zebrafish caudal fin vertebral fusion as a potential model to study both congenital and postsegmentation fusion and we present candidate factors and genes that may be further explored in order to clarify whether we can prevent vertebral fusion.

A coluna vertebral e as sua unidade estrutural, a vértebra, são componentes fundamentais, transversais a todos os vertebrados. A separação dos corpos vertebrais durante o desenvolvimento como unidades articuladas é um requisito necessário para que a coluna vertebral desempenhe a sua função de forma adequada. Quando as vértebras fundem durante o desenvolvimento ou após a formação da vértebra, a mobilidade do individuo é afectada de uma forma mais ou menos severa, dependendo do número de vértebras afectadas. No entanto, é de considerar que a fusão vertebral também ocorre como requisito fisiológico durante o desenvolvimento, tal como acontece na região sacral dos tetrápodes ou no uróstilo dos teleósteos. Este doutoramento tem como objectivo compreender os mecanismos moleculares e celulares por trás da fusão vertebral em condições fisiológicas e patológicas, utilizando o peixe zebra como modelo. Para o efeito, aprofundou-­‐se caracterização da fusão vertebral da região da barbatana caudal do peixe zebra. Esta caracterização demonstrou que a região da barbatana caudal resulta da fusão de cinco corpos vertebrais em vez de três como originalmente descrito. No entanto apenas a fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+] ocorre em todos os indivíduos durante o desenvolvimento. Por outro lado, as restantes fusões raramente são observadas, e resultam do desenvolvimento directo do corpo vertebral composto. No caso da fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+], a mineralização da região intervertebral ocorre em torno da notocorda, com formação de matriz óssea mineralizada, após formação segmentada do vértebras. Esta fusão é considerada uma fusão ontogénica, comparável com fusão pós-­‐natal. De igual modo, a fusão entre os restantes corpos ocorre a nível da matriz da notocorda, tal como a mineralização do próprio corpo vertebral, sugerindo uma interferência da segmentação vértebra. Este tipo de fusão, classificada como fusão evolutiva, estará mais próxima de um processo congénito onde a segmentação da vértebra não chega a ser estabelecida. De modo a obter estruturas de referencia onde não ocorre fusão vertebral para o estudo comparativo com a região da barbatana caudal, foi feita uma caracterização detalhada da coluna vertebral completa do peixe zebra. Esta análise demonstrou que independentemente da região vertebral, proteínas associadas ao processo de mineralização como a Osteocalcina, estão presentes na matriz da notocorda durante a primeira fase de mineralização do cordacentro. A presença inesperada desta proteína numa matriz não óssea, traduziu-­‐se numa caracterização mais detalhada dos dois genes Oc presentes no peixe zebra. Deduziu-­‐se que estávamos na presença de Oc1, uma vez que a expressão da Oc2 aparece em fases mais tardias, potencialmente associada à formação de osso. Apesar deste ponto comum, foram identificados processos de mineralização distintos entre as vértebras da região da barbatana caudal e restantes, associados a morfologias distintas e eventualmente aliados à predisposição da vértebra para fundir ou não. Uma vez que uma análise meta-­‐transcriptómica exige um cuidado considerável na selecção das amostras a utilizar, concluímos que comparar a região da barbatana caudal com uma região anterior traria um grande número de genes associados à morfologia distinta, mascarando genes potencialmente associados ao processo de fusão. Deste modo, após uma pesquisa bibliográfica detalhada, verificámos que com exposição a ácido retinóico durante o desenvolvimento das vértebras obteríamos um fenótipo de fusão vertebral que poderia ser comparado com o mesmo tipo de vértebras em condições controlo. Após uma análise por microarray, foi obtido um conjunto considerável de genes, potencialmente associados aos mecanismos de fusão vertebral. Alguns destes genes foram então associados com as várias alterações verificadas a nível morfológico, em particular com alterações da notocorda, que incluíam mineralização ectópica da matriz e não formação pericordal de osso por aumento de actividade osteoblástica, como previamente sugerido. Os grupos dominantes de genes regulados na presença de ácido retinóico incluíam componentes de matriz extracelular, adesão celular e coagulação sanguínea, os quais foram discutidos no contexto de fusão vertebral. Finalmente, a proteína gla da matriz (Mgp), identificada como sobre-­‐expressa 25x na presença de ácido retinóico, foi relacionada com os locais de mineralização do cordacentro no desenvolvimento regular da coluna vertebral. Simultaneamente, foi feita uma análise detalhada dos níveis de expressão deste gene ao longo do desenvolvimento e em diferentes tecidos, tendo sido identificado em fases iniciais do desenvolvimento embrionário e em todos os tecidos analisados. O bloqueio da tradução da Mgp durante o desenvolvimento embrionário levou à malformação do embrião, com redução do alongamento da parte caudal do organismo. Estudos anteriores em membros de galinha levaram à conclusão que a Mgp poderia estar associada ao processo de diferenciação celular. Esta referência juntamente com os nossos resultados leva à hipótese de que a Mgp posso ter uma função distinta ou complementar à descrita a nível da inibição da mineralização, podendo estar associada ao processo de desenvolvimento e fusão vertebral. Para validar esta questão é necessária uma análise funcional com expressão manipulada da Mgp, verificando se tem a capacidade induzir fusão em vértebras separadas, ou prevenir fusão nas vértebras da região da barbatana caudal. Deste modo, introduzimos a região vertebral da barbatana caudal como potencial modelo onde é possível estudar fusão congénita e post-­‐natal. Simultaneamente, propomos um conjunto de genes potencialmente associados ao processo de fusão, que poderão ser explorados de futuro na tentativa de encontrar um factor que permita prevenir fusão vertebral.

Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina