Effects of nanoparticles exposure in the mussel Mytilus Galloprovincialis

Tese de dout., Ciências do Mar, Terra e Ambiente (Ecotoxicologia), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2012

Nanotechnology is rapidly developing and attracting attention due to the exploitation of the novel materials at the nanoscale for application within biomedical, cosmetic, electronic, energy production and environmental sectors. Increased production and widespread use of these nanomaterials result in their release into the environment; nevertheless, the knowledge of their behaviour in aquatic systems is scarce. Accordingly, this thesis assessed the effects of two commercially available nanoparticles, copper oxide (CuO NPs) and silver nanoparticles (Ag NPs), using mussels Mytilus galloprovincialis as bioindicators. To understand the uptake, accumulation and effects of these NPs, mussels were exposed to a realistic environmental concentration of 10 !g.L-1 of CuO (31 ± 10 nm) and Ag NPs (<100 nm) for 15 days, comparative to their ionic counterparts. NPs were characterized and biomarkers of oxidative stress, metal exposure, genotoxicity and neurotoxicity evaluated in mussel tissues. To identify pathways of NP exposure and detect new biomarkers, a proteomic approach was undertaken. Oxidative stress is the major NP-induced toxicity, but with distinct modes of action. Gills are more susceptible to oxidative stress while the digestive gland is the preferential site for NPs accumulation. The oxidative (enzymatic activation/inhibition, metallothionein induction and lipid peroxidation), genotoxic (DNA strand breaks) and neurotoxic (acetylcholinesterase inhibition) changes suggest that NPs toxicity is associated with ROS that induced a cascade of pathways (via nucleus and mitochondria) that ultimately lead to apoptosis but by different mechanisms. New biomarkers candidates were identified: caspase 3/7-1, cathepsin-L and zinc-finger protein for CuO NPs and precollagen-P, major vault protein and ras partial for Ag NPs exposure. Overall, these results show that even though oxidative stress and apoptosis are similar outcomes for NP toxicity, particle composition, size, solubility, aggregation and chemistry are key elements for determining their mode of action. This study contributed to understand the CuO and Ag NPs behaviour, bioavailability and toxicity in aquatic systems and their uptake and effects in filter-feeding organisms.

A nanotecnologia é uma indústria de grande rentabilidade mundial e em crescente desenvolvimento que consiste na produção ou alteração de substâncias à nanoescala (dimensão entre 1-100 nm) cujas características permitem uma crescente aplicação em diversos setores industriais e comerciais como a medicina, farmácia, cosmética, produção de energia, eletrónica e ambiente. O rápido desenvolvimento e uso generalizado destes nanomateriais torna inevitável a sua libertação para o ambiente e para o ambiente aquático em particular. No entanto, o conhecimento sobre o comportamento destes nanomateriais nos sistemas aquáticos, bem como a sua capacidade de acumulação nos organismos e consequente toxicidade é ainda escasso. Deste modo, esta dissertação teve como objetivo avaliar os efeitos ecotoxicológicos de duas nanopartículas metálicas com várias aplicações a nível comercial e industrial, nanopartículas de óxido de cobre (NPs CuO) e de prata (NPs Ag), utilizando o mexilhão Mytilus galloprovincialis como espécie bioindicadora. Para compreender a biodisponibilidade, acumulação e efeitos destas nanopartículas, os mexilhões M. galloprovincialis foram expostos a uma concentração ambientalmente relevante de 10 !g.L-1 de NPs CuO (31 ± 10 nm) e 10 !g.L-1 de NPs Ag (<100 nm) durante 15 dias, e os efeitos comparados simultaneamente com as respetivas formas iónicas (Cu2+ e Ag+). As NPs foram caracterizadas em termos de forma e tamanho (diâmetro hidrodinâmico), carga superficial (potencial zeta), índice de poli-dispersidade e intensidade, utilizando suspensões em água ultrapura e água do mar. Foi utilizada uma bateria de biomarcadores nas brânquias e glândula digestiva dos mexilhões, nomeadamente biomarcadores de stress oxidativo (enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase e peroxidação lípidica), de exposição metálica (metalotioninas), genotoxicidade (dano de ADN) e de neurotoxicidade (acetilcolinesterase). Para identificar possíveis mecanismos de ação das NPs e identificar novos biomarcadores de exposição e efeito foi também efetuada uma análise proteómica. A solubilidade das NPs e a libertação de iões metálicos (Cu2+ e Ag+) em conjunto com as propriedades inerentes às NPs são responsáveis pelos diferentes efeitos encontrados ao longo do tempo de exposição. Ambas as nanopartículas foram acumuladas nos dois tecidos ao longo do tempo de exposição, com exceção de um decréscimo de acumulação das NPs Ag nas brânquias no final da experiência. De um modo geral, as brânquias são mais suscetíveis a stress oxidativo (através dos iões metálicos que se dissolvem das NPs), enquanto a glândula digestiva é o tecido preferencial para a acumulação das NPs na forma de agregados. O comportamento dos biomarcadores foi diferente para cada uma das nanopartículas, consoante o tecido considerado. Contudo, o stress oxidativo foi o mecanismo mais significativo de ação das NPs CuO e Ag, que difere do obtido para as correspondentes formas iónicas. Os dois tipos de nanopartículas alteraram o sistema de defesa antioxidante dos mexilhões através da indução/inibição da atividade das enzimas antioxidantes. Adicionalmente, foi também observada uma indução de metalotioninas nas brânquias e glândula digestivas expostas a ambas as NPs, diretamente relacionada com a sua acumulação nos dois tecidos. As glândulas digestivas dos mexilhões expostos a NPs Ag foram a exceção, já que neste tecido a Ag está maioritariamente associada a formas insolúveis nos lisossomas. As NPs CuO originaram peroxidação lipídica nos dois tecidos, enquanto que no caso das NPs Ag apenas foi detetada peroxidação lipídica nas brânquias. O potencial neurotóxico foi avaliado apenas nas brânquias expostas a NPs de CuO, onde foi observada uma inibição da atividade da acetilcolinesterase no final da experiência. Verificou-se ainda que tanto as NPs de CuO como de Ag têm efeitos genotóxicos nos hemócitos dos mexilhões (quebras nas cadeias de ADN), efeitos esses que parecem ser mediados pelo stress oxidativo. Os perfis de expressão proteica obtidos dependem do tecido e da forma de metal considerado (NP vs iónico), e permitiram identificar proteínas diferencialmente expressas (induzidas ou inibidas) associadas aos mecanismos de acumulação das NPs. A identificação de 15 destas proteínas confirmou o potencial oxidativo de ambas as NPs e permitiu perceber que a exposição a estas NPs origina várias cascatas de sinalização celular no núcleo e mitocôndria que em último caso podem originar apoptose. A análise proteómica permitiu também a identificação de alguns biomarcadores clássicos (proteínas de stress térmico, actina, glutationa s-transferase, ATP sintase), bem como novos biomarcadores moleculares resultantes da exposição de NPs de CuO (caspase 3/7-1, catepsina L e proteína de dedo de zinco) e Ag (pré-colagénio P, ribonucleo-proteína citoplasmática MVP e ras parcial). Os resultados obtidos demonstraram que apesar do stress oxidativo e a apoptose serem efeitos tóxicos semelhantes entre as duas NPs, a composição, tamanho e distribuição, solubilidade, aglomeração e química das partículas são elementos determinantes para decifrar o seu modo de ação. Deste modo, este estudo contribuiu para perceber a importância da solubilização, agregação, biodisponibilidade e toxicidade das NPs nos sistemas aquáticos bem como o seu comportamento, acumulação e efeitos em organismos filtradores.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)