Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

A autofagia é um mecanismo celular, presente em todas as células eucariotas, responsável pela degradação e reciclagem de proteínas de longa vida e organelos danificados. É caracterizada pela formação de uma vesícula de membrana dupla, designada autofagossoma, que captura as proteínas ou os organelos a degradar e, posteriormente, se funde com lisossomas, levando à degradação dos substratos. Embora ocorra ao nível basal, a sua estimulação é normalmente provocada por sinais de privação de nutrientes ou energia, sendo por isso, um mecanismo de resposta ao stress, com o intuito de recuperar nutrientes ao nível celular e repor a homeostasia. No entanto, a sua importância ao nível do organismo vai muito mais longe, sendo que está envolvida na degradação de agregados proteicos, que podem levar a doenças neurodegenerativas, bem como na prevenção da tumorogénese. De facto, o seu mau funcionamento pode mesmo levar a estas ou outras condições patológicas. Retardando doenças normalmente associadas ao envelhecimento, está também envolvida no aumento da longevidade de organismos eucariotas. No entanto, a estimulação desregulada de autofagia pode também ser prejudicial, levando à morte celular por apoptose, razão pela qual a sua indução é, necessariamente, bem controlada. A principal via de sinalização responsável pela indução de autofagia passa pela inibição da cinase de serina/treonina mTOR (do inglês, mammalian target of rapamycin). Esta enzima é um dos principais “interruptores” metabólicos da célula, determinando se esta deve gastar energia e proliferar, ou, pelo contrário, produzir energia, reciclando conteúdo citoplasmático. Um dos seus principais substratos, a S6K1/p70, regula a expressão proteica, modulando a tradução ao nível dos ribossomas. Existem muitas proteínas envolvidas na regulação da autofagia, normalmente designadas Atg (do inglês autophagy-related genes). Especificamente, a MAP1LC-3 (do inglês microtubule associated protein 1 light chain 3), ou simplesmente LC-3, que participa na formação dos autofagossomas e é o principal marcador utilizado no estudo da indução de autofagia. Esta proteína pode assumir duas formas: forma lipidada, designada LC-3II, ou não lipidada, designada LC-3I. A LC-3I encontra-se normalmente dispersa no citoplasma celular, no entanto, ao haver a indução de autofagia, associa-se a uma fosfatidiletanolamina, convertendo-se em LC-3II e ligando-se às membranas do autofagossoma. Essa conversão, analisável por Western blotting, é o melhor marcador actualmente existente para a autofagia. A restrição calórica (CR, do inglês calorie restriction) é um conhecido indutor de autofagia, tendo, no entanto, implicações muito mais variadas nos organismos, desde a alteração da secreção de hormonas, ao aumento da resistência ao stress oxidativo. Esse mecanismo de aumento da resistência a stresses ambientais é conhecido como hormese, sendo a hipótese que melhor se adequa aos efeitos da CR. Foi demonstrado que a CR previne o surgimento de cancro e doenças neurodegenerativas, pelo que é um potente alvo terapêutico. A CR é, também, a mais eficaz terapia para o aumento da longevidade, havendo estudos que o comprovam em eucariotas inferiores e superiores, bem como indícios favoráveis em estudos a decorrer em primatas. Existem, assim, muitas semelhanças entre os efeitos da autofagia e da CR, mas mesmo sabendo que a CR induz autofagia, os mecanismos envolvidos não estão ainda totalmente esclarecidos, uma vez que a CR produz uma grande variedade de alterações fisiológicas. Um dos principais efeitos neuroendócrinos da CR é a libertação de neuropéptido Y (NPY), o mais potente factor orexigénico endógeno conhecido. Este péptido é principalmente produzido e libertado no hipotálamo, o centro da fome e saciedade, mas produz efeitos ao nível de todo o organismo. Actua através de pelo menos 5 receptores, designados receptores NPY, acoplados a proteína G, levando à inibição da enzima adenilato ciclase e do consequente aumento de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). Adicionalmente, tem efeito neuroprotector em vários tipos celulares, prevenindo a apoptose por excitotoxicidade. Tendo um papel muito abrangente em resposta à privação de nutrientes, não seria estranho que estivesse envolvido na regulação da autofagia induzida por CR. No entanto este envolvimento nunca foi estudado. Os objectivos deste estudo passaram, então, por verificar o efeito do NPY na indução de autofagia em culturas de células hipotalâmicas e, de seguida, verificar o seu papel na autofagia induzida por CR. Foi também pretendido verificar as vias de sinalização activas, aquando a possível indução de autofagia. Como modelos celulares, foram utilizadas a linha mHypoE-N42 (N42), de neurónios embrionários de murganho e culturas primárias de células hipotalâmicas neurais diferenciadas de rato, originadas a partir de neuroesferas hipotalâmicas embrionárias. Este estudo demonstrou que o NPY induz autofagia em culturas in vitro de células hipotalâmicas. Analisando o rácio entre LC-3II e LC-3I, verificou-se que este aumentava após tratamento com NPY, de uma forma dependente do tempo de incubação, nos dois modelos in vitro de células hipotalâmicas. Utilizando um inibidor de degradação lisossomal – cloroquina – comprovou-se o aumento de fluxo autofágico em células N42, uma vez que se observou a acumulação da forma LC-3II. Verificou-se, também, que a utilização de antagonistas dos receptores Y1, Y2 e Y5 de NPY, aparentemente, preveniu esse efeito, em parte, o que fortaleceu a hipótese de que o NPY esteja, de facto a induzir autofagia. Com o objectivo de determinar se o NPY estaria a induzir autofagia através da via canónica, avaliou-se a fosforilação de mTOR e um dos seus substratos, p70. No entanto, não se verificou qualquer alteração significativa na fosforilação do mTOR ou da p70, indicando que o NPY poderá estar a induzir autofagia por uma via independente de mTOR. Para estudar o eventual papel do NPY na autofagia induzida por CR, as culturas celulares foram submetidas a meios com baixo teor energético e incubadas com antagonistas de receptores de NPY. Verificou-se que os antagonistas aparentemente preveniram, em parte, a autofagia induzida por CR, em células N42, sendo que nas células hipotalâmicas neurais diferenciadas ainda é necessário um maior número de experiências. Foi ainda verificado que a privação de nutrientes levava a um aumento da expressão de NPY, indicando que este poderá, de facto, ter um importante papel na indução de autofagia, após CR. Estes resultados são a base para um estudo mais aprofundado do papel do NPY na regulação do fluxo autofágico. A utilização de outros modelos experimentais contribuirá para a melhor compreensão destes fenómenos e da importância do NPY como resposta à privação de nutrientes.