Técnicas biomoleculares no diagnòstico e tipificação em virologia vegetal

Tese de dout., Ciências Agrárias (Protecção de Plantas), Unidade de Ciências e Tecnologias Agrárias, Univ. do Algarve, 1994

O diagnóstico é um dos principais meios de protecção de plantas em virologia vegetal. Muito frequentemente seria vantajoso poder ainda complementar o diagnóstico com informação sobre as estirpes que estão presentes num dado contexto epidemiológico. Na maior parte dos casos isto não é possível devido à inexistência de métodos apropriados de tipificação viral. Esta limitação tem também dificultado estudos de âmbito mais teórico que envolvem a identificação de estirpes presentes em populações naturais e que permitiriam melhor delinear as estratégias protecção. Num pequeno número de casos tem sido possível obter esta informação pela análise dos perfis electroforéticos obtidos pelo fracionamento de RNA bicatenário de origem viral ou, mais recentemente, a partir da análise dos genomas virais amplificados por PCR. Neste trabalho estudam-se métodos capazes de serem aplicados em condições de rotina ao diagnóstico viral e à identificação de isolamentos de vírus, desenvolvendo-se em três partes. No primeiro capítulo estuda-se a aplicabilidade da análise de RNA bicatenário ao diagnóstico viral, empregando para tal diversos vírus e hospedeiros. Verifica-se que este método é muito dependente do hospedeiro e desenvolvem-se protocolos de extracção de ácidos nucleicos que podem ser empregues com hospedeiros considerados difíceis, tais como a videira. Não são contudo protocolos que possam ser empregues em condições de rotina. Outras limitações provêm ainda da existência de RNA bicatenários endógenos que foram encontrados em vários hospedeiros. Para além destes problemas, a possibilidade de identificar estirpes depende ainda da estratégia de expressão genómica do vírus e do hospedeiro estar a vegetar em condições apropriadas para a manifestação do perfil completo de bandas. Em comparação com outros métodos que vieram a ser desenvolvidos neste trabalho, a análise de RNA bicatenário apresenta um interesse limitado quer no diagnóstico quer na tipificação viral. Poderá ter interesse como método exploratório no estudo de doenças de etiologia presumivelmente viral ainda não esclarecida, como por exemplo o mosaico da figueira, tratado neste trabalho. Esta doença aparece relacionada com um perfil electroforético composto de várias bandas de que sobressaem duas correspondentes a fragmentos de RNA bicatenário com cerca de 10-12 Kbp e 2,2 Kbp. Estas moléculas poderão estar relacionadas com a replicação de vírus de RNA possívelmente envolvido(s) na patogénese. Na segunda parte estudam-se os métodos de diagnóstico baseados na amplificação in vitro de determinadas partes do genoma viral. Deste estudo resultou um método de diagnóstico (IC/RT-PCR) de elevada sensitividade que evita a extracção de ácidos nucleicos, o que não acontecia na metodologia até então disponível. Os viriões são capturados directamente do extracto da planta mediante anticorpos adsorvidos sobre a superfície de uma fase sólida, provavelmente sofrendo uma distorção que possibilita a iii extracção e transcrição do genoma pela RTase, seguindo-se a sua amplificação por PCR e quantificação dos resultados por fluorimetria. Todo o processo pode ser efectuado numa placa de microtitulação, sendo concebível um grau de automatização equivalente ao da técnica ELISA. Este método foi objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1992). A sua validade foi verificada com vírus de diversos grupos (Potyvirus, Nepovirus, Cucumovirus, Closterovirus, Luteovirus, Tobamovirus, Tospovirus) e com RNA satélites de CMV e GFLV. Num pequeno rastreio de CTV e GFLV, comprovou-se a incapacidade da técnica ELISA em detectar o vírus em várias amostras positivas por IC/RT-PCR. Por outro lado, no caso do GFLV não foi possível amplificar alguns isolamentos positivos por ELISA. Este facto foi atribuído a uma inesperada variabilidade genómica e reforça a necessidade de se efectuarem estudos de variabilidade genómica de vírus. Alternativamente à captura por anticorpos específicos, é possível capturar os genomas virais por meio de anticorpos para RNA bicatenário, o que permite alargar o âmbito desta metodologia a patogéneos desprovidos de proteína estrutural. Na terceira parte estudou-se a conjugação da amplificação genómica por IC/RTPCR com métodos de análise mutacional com vista ao desenvolvimento de métodos de tipificação genómica de vírus. Dois destes métodos, a análise de polimorfismos conformacionais monocatenários (SSCP) e de polimorfismos de locais de restrição (RSP) empregam como técnica preparativa a amplificação específica por IC/RT-PCR e foram objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1993a). Um terceiro método, a Síntese Aleatória de cDNA (SAcDNA), baseia a tipificação no aproveitamento das condições pouco restritivas da transcrição reversa para iniciar, por jusante, mediante um iniciador inespecífico, um conjunto de moléculas característico do isolamento viral, que é em seguida amplificado em condições normais de restritividade. Este método foi também objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1994b). São características gerais dos métodos apresentados poderem ser aplicados directamente ao extracto da planta a analisar, serem independentes do hospedeiro e, comparativamente com outros métodos, serem muito pouco laboriosos. Como modelo de aplicação empregou-se uma série de isolamentos de GFLV e CTV, grande parte mantidos em condições naturais. Obteve-se o melhor poder discriminante com SAcDNA. Para além da discriminação, a análise por RSP permitiu ainda o estudo de relações entre isolamentos e a avaliação quantitativa da diversidade genética de populações de GFLV e CTV, o que não havia sido feito prèviamente. Verificou-se que o gene da proteína do capsídeo do GFLV é altamente variável e que o distanciamento genético entre isolamentos não se relaciona com o distanciamento espacial entre as plantas, mesmo quando lado a lado. A diversificação do CTV segue um modelo distinto, relacionando-se a proximidade geográfica com a proximidade genética entre os isolamentos e não se atingindo diversidades tão elevadas como para o GFLV.

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