Identificação de indicadores moleculares de bem-estar durante o cultivo de dourada (Sparus aurata, Linnaeus 1758), utilizando técnicas de proteómica

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Especialização em Biotecnologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2008

O bem-estar dos organismos produzidos em aquacultura tornou-se, na actualidade, um dos aspectos fundamentais desta indústria. O principal objectivo deste trabalho foi tentar identificar indicadores moleculares de bem-estar durante o cultivo de Sparus aurata, através da análise da expressão das proteínas do fígado. O fígado será o órgão alvo deste estudo, pois é onde estão activos a maioria dos processos chave do metabolismo dos peixes, e como tal, será o órgão mais rapidamente afectado em condições de stress crónico. Foi comparado o proteoma entre peixes sujeitos a condições óptimizadas de cultivo (CTRL) e condições indutoras de stress crónico (manuseamento regular – MAN e densidades de cultivo elevadas – DEN), utilizando a técnica de separação de proteínas, a electroforese bidimensional. Esta técnica demonstrou ser eficaz na identificação de biomarcadores relacionados com o stress. Foram detectados 560 spots (PDQuest 2-D Analysis Software – BioRad) e a análise estatística (teste não paramétrico Mann-Whitney, p < 0,05) revelou a existência de proteínas com expressão diferenciada entre as diferentes condições: 235 proteínas diferem entre CTRL e MAN e 223 proteínas diferem entre CTRL e DEN. Apenas 70 proteínas diferem entre as duas condições de stress. As proteínas com um nível de expressão ≥ 2x entre as várias condições, foram consideradas relevantes e sequenciadas por LC- MS/MS, de modo a serem identificadas por peptide fragmentation fingerprinting. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a expressão diferencial de proteínas, muitas delas já previamente relacionadas com stress, estando envolvidas em vários processos e vias metabólicas. Os dois principais indicadores moleculares identificados foram: a heat shock cognate protein 70 (Hsc70) e a fatty acid binding protein (FABP). Outras proteínas, tais como, as proteínas envolvidas no metabolismo dos carbohidratos (isomerase da triose fosfato, desidrogenase do gliceraldeído 3-fosfato, alfa enolase, desidrogenase beta do piruvato) e a sintetase da glutamina poderão possivelmente ser utilizados no futuro, após a realização de mais estudos acerca destas enzimas e do seu papel em situações de stress crónico. Futuramente, com o auxílio destes indicadores moleculares, poderão ser desenvolvidos testes práticos e ferramentas genómicas para estudar o bem-estar de peixes em aquacultura. Estes biomarcadores poderão ainda ser utilizados em processos de certificação de produtos de elevada qualidade produzidos pelos sistemas semiintensivos que caracterizam a aquacultura portuguesa.

The welfare of aquaculture organisms has become nowadays one of the main concerns of this industry. The main aim of this work was to identify molecular indicators of welfare during the production of Sparus aurata, through the expression analysis of liver proteins. The liver is the target organ of this study, as it is where the main key fish metabolism processes are active, being therefore the more likely organ to be fastly affected in chronic stress conditions. The proteome was compared in fishes submitted to optimized conditions of culture (CTRL) and chronic stress inductive conditions: regular handling – MAN; and high stocking densities – DEN; using a protein separation technique - two-dimensional electrophoresis. This technique was shown to be efficient in stress related biomarkers identification. 560 spots were detected (PDQuest 2-D Analysis Software – BioRad) and the statistic analysis (non parametric Mann-Whitney, p<0,05) revealed the existence of proteins differentially expressed in the culture conditions tested: 235 proteins show differences between CTRL and MAN while 223 differ between CTRL and DEN. Only 70 proteins varied among the two stress conditions. The proteins with an expression level > 2x were considered relevant and were sequenced by LC- MS/MS, so they could be identified by peptide fragmentation fingerprinting. The results obtained in this study revealed differential expression of several proteins, some of them previously related to stress and being involved in several processes and metabolic pathways. The two main molecular indicators identified were: the heat shock cognate protein 70 (Hsc70) and the fatty acid binding protein (FABP). Other proteins, as the ones involved in the carbohydrate metabolism (triosephosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, alpha enolase, pyruvate dehydrogenase) and glutamine synthetase may be used in the future, after more studies are done on these enzymes and their role in chronic stress situations. It can be forecasted that with help of these molecular markers, practical tests and genomic tools may be developed to study the welfare of fish in aquaculture. These biomarkers might also be used in certification processes of the high quality fish produced by semi-intensive systems characteristic of Portuguese aquaculture.