Análise e caracterização da expressão e papel funcional dos potenciais genes da família 2 GPCRs no protostómio Caenorhabditis elegans

Dissertação de Mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Universidade do Algarve, 2009

Os receptores da família 2 GPCR (G Protein Coupled Receptors) e seus péptidos ligandos são um dos principais sistemas endócrinos (receptor-hormona) de vertebrados com elevado interesse terapêutico. Recentemente, em invertebrados, membros potencialmente orfãos desta família foram identificados in silico e estudos sobre a sua origem e função poderão contribuir para uma melhor compreensão do estabelecimento, regulação e papel fisiológico do par hormona-receptor. Neste trabalho, foram isolados e caracterizados receptores da família 2 GPCR em Caenorhabditis elegans utilizando comparações in silico, ensaios funcionais in vitro e in vivo na presença de péptidos humanos e com diferentes concentrações de cálcio no meio. Os três receptores identificados são homólogos em sequência aos receptores CAL/CGRP e CRF de vertebrados. Análises in silico sugerem que foram originados através de dois processos de duplicação de genes que ocorreram em nemátodes sendo o receptor CelZK643.3 potencialmente mais semelhante ao gene ancestral que lhes deu origem. Estudos de expressão sugerem que estes receptores são biológicamente activos e possuem um papel importante no ciclo de vida do nemátode sendo expressos ao longo das diferentes fases do seu desenvolvimento. Estudos in vivo e in vitro indicam que os receptores CelC13B9.4 e CelZK643.3 poderão ter funções fisiológicas semelhantes sendo estimulados na presença dos péptidos hAMY e hPTH e elevadas concentrações de cloreto de cloreto de cálcio, enquanto que a expressão do receptor CelC18B12.2 foi completamente inibida podendo este ter adquirido funções distintas após a sua origem.

G Protein Coupled Receptors (GPCR) family 2 and their ligand peptides are one of the most important vertebrate endocrine (hormone-receptor) systems with high therapeutic value. Recently, in invertebrates potentially orphan members of this family were identified in silico, and assessing their origin and function may contribute for better understanding the establishment, regulation and physiological role of the hormone-receptor pair and ther function. In this work, we isolated and characterized three receptors of the 2GPCR family in Caenorhabditis elegans by in silico comparison and in vitro and in vivo functional assays in the presence of human peptides and in different calcium cloride concentrations. The three receptors are homologous in sequence with the vertebrate CAL/CGRP and CRF receptors. In silico analysis suggest that they were originated by two gene duplication processes in nematodes, and that CelZK643.3 receptor is potentially more similar to the ancestral gene that originated them. Expression assays suggest that these receptors are biologically active and play an important role in the nematode life cycle since they are expressed throughout all phases of their development. In vivo and in vitro assays indicate that the CelC13B9.4 and CelZK643.3 receptors may have similar physiological functions and both stimulated in the presence of hAMY and hPTH peptides and high concentrations of calcium cloride. However, the expression of the CelC18B12.2 receptor was completely inhibited and therefore this receptor may have developed a different function after its origin.