Mechanical cell lysis technique for plasmid recovery

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Universidade do Algarve, 2008

A necessidade de grandes quantidades de plasmídeos de ADN tem vindo a aumentar, recentemente devido ao sucesso dos testes clínicos de terapia genética. A terapia genética é a transferência de material genético para o organismo humano, modificando o seu repertório genético, para fins terapêuticos1. A terapia genética abre um novo mercado, estimado em cerca de 45 bilhões de US$ até 20102. O plasmídeo é produzido pelas células e libertado através da sua ruptura. Por isso tem-se vindo a desenvolver métodos de purificação de plasmídeos em larga escala. A lise celular é um dos passos importantes e críticos na purificação de plasmídeos. Por isso, têm sido desenvolvidos e optimizados métodos de lise celular, capazes de serem usados para produção em larga escala em que permitam a libertação de plasmídeos intactos. Actualmente a lise alcalina é a técnica mais utilizada na libertação de plasmídeos. Esta técnica primeiramente desenvolvida por Birnboim et al.33, tem sido desde então empregada na purificação de plasmídeo em escala laboratorial. Este método consiste na utilização de três soluções: (i) Tris-HCl, um quelante (geralmente EDTA), e glucose usada para ressuspender a pasta celular; (ii) NaOH e um agente de solvatação, SDS (dodecilsulfato de sódio) que é a solução activa na lise; (iii) a solução de neutralização que normalmente é acetato de potássio. As proteínas sofrem desnaturação parcial e o SDS liga-se a elas misturando sua cadeia alifática ao cerne hidrofóbico das proteínas semi-desnaturadas. O ADN da bactéria não se desliga das proteínas semi-desnaturadas e é alvo de precipitação pela acção da solução (iii). O ADN genómico da bactéria é também precipitado, deixando o plasmídeo no sobrenadante. A sua conjugação com outros métodos como a lise térmica, o emprego de lisozimas, o choque osmótico, ciclos de congelação/descongelação, têm sido utilizados como forma de ter um método integrado de melhor performance. Mesmo assim, a lise alcalina tem algumas limitações como a elevada viscosidade, dificuldades na agitação, alto volume necessário para o tratamento duma quantidade pequena de plasmídeo o que torna complicado o seu emprego para produção de plasmídeos em grande escala. A lise mecânica que é empregada com sucesso na lise de células para obtenção de proteínas, não tem sido muito usada, porque as altas tensões de corte entre outros parâmetros danificam a integridade do plasmideo. A integridade do plasmídeo é muito importante uma vez que mecanismos de regulação como a USFDA(United States Food and Drug viii Administration) recomendam que haja uma razão de 90% de plasmídeo no estado superenrolado em relação às outras isoformas4. Mesmo assim o moínho de bolas foi empregado com algum sucesso na disrupção de células para libertação de plasmídeo, sendo relatado uma taxa de libertação de 90% de plasmídeos intactos, só que para 50% de lise. O sucesso na aplicação de agentes compactantes para proteger o plasmídeo, abre novas fronteiras para a aplicação da lise mecânica. Diferentes materiais químicos já foram utilizados para compactar o plasmídeo com sucesso, como álcoois, proteínas, iões divalentes e trivalentes ou polímeros catiónicos5-8. A compactação ou condensação consiste na utilização de químicos que provocam uma drástica redução do tamanho aparente das moléculas de ADN, através de neutralizações de cargas. O objectivo deste trabalho foi a utilização de lise mecânica na presença de agentes compactantes para a libertação de plasmídeos sem que a sua integridade fosse comprometida, aproveitando dessa forma a maquinaria existente utilizada na produção de proteínas. O agente compactante usado foi uma solução de cloreto de cálcio e tert-butanol, que são dois agentes compactantes mais baratos disponíveis. A sonicação foi a técnica de lise mecânica aplicada uma vez que é uma das técnicas mais agressivas para a integridade do plasmideo. Esta agressividade é provocada pela cavitação que causa a formação e actividade de bolhas de ar no meio sonicado. A alta tensão de corte gerada e a formação de radicais livres acabam por danificar o plasmídeo reduzindo-o a pequenos fragmentos ou em isoformas que não interessam. Os primeiros resultados dão prospectivas de alto potencial da aplicação desta técnica. Várias concentrações de cloreto de cálcio em 20% de tert-butanol foram testadas. O objectivo era o de encontrar uma concentração de cloreto de cálcio que para além de proteger o plasmídeo durante a lise, permitisse também que este precipitasse e ficasse no pellet com os fragmentos celularess, permitindo assim que as proteínas ficassem no sobrenadante e fossem assim eliminadas. Posteriormente os fragmentos celulares contendo o plasmídeo seriam ressuspendidos utilizando uma solução que provocasse a resolubilização do plasmídeo. Uma outra centrifugação seria feita de forma a remover os fragmentos celulares e ficar com o plasmídeo em solução. Foi possível libertar plasmídeos com uma fracção significativa no estado superenrolado. Partindo de uma amostra de 1 mL a 8,5 g/L de concentração em células, foi possível obter 7,97 μg de plasmídeo por mg de células (peso seco) a 13,82 % de pureza, o que é cerca de 4 vezes mais puro de que o que se obtém com a lise alcalina (3,95), para a mesma quantidade de plasmídeo libertado na lise alcalina (8,07 μg de ix plasmídeo por mg de células (peso seco)). Apesar disso também foi possível precipitar o plasmídeo libertado enquanto que a proteína ficava suspensa na solução, o que indica que uma grande parte de proteínas é removida sem emprego de técnicas especificas de remoção da mesma. ARN que é um dos contaminantes mais difíceis de separar dos plasmideos também é capaz de ser separado, uma vez que a precipitação de plasmídeos é muito superior à precipitação de ARN, possibilitando assim a remoção de uma quantidade significativa da mesma. Isso tudo torna os passos posteriores de purificação menos laborioso e custoso.

The demand for plasmid DNA (pDNA) has been increasing recently due to the exponential growth and importance of gene therapy. So lysis methods, which can easely be scaled-up are needed once one of the biggest constraint in plasmid downstream processing is the lysis step. Currently alkaline lysis or alkaline lysis combined with other lyses method such as osmotic shock, lyzozimes, freeze-thawing or thermal lysis. These techniques have drawbacks which makes necessary the development of other lysis techniques or the optimization of them. So far, mechanical lysis has not been very successfully, even though high recovery yield of plasmid has been reported for bead mills but only for 50% of cell disruption. The protection of plasmid DNA by compaction agents reported opens the possibility of mechanical lysis for plasmid DNA recovery. In this work lysis for plasmid recovery was performed by sonication in presence of plasmid DNA. CaCl2 and tert-butanol was used once they are inexpensive. Early results show interesting prospects since it was possible to sonicate cells in presence of compaction agents whilst preserving the integrity of plasmid DNA. Starting with 1 mL of sample at 8.5 g/L of dry cell weight, we obtained 1 mL of plasmid DNA at 7.97 μg of plasmid per mg of cell, with 13.82% of purity after ressuspension which is nearly 4 times more purified than alkaline lysis (3.95%), for the same amount of plasmid released (8.07 μg of plasmid per mg of cell). It was possible to precipitate the plasmid with compacting agents during lysis, permitting the removal of some amount of proteins. RNA which is another important contaminant can also be selectively precipitated, removing so part of the RNA released during lysis. Another important end result is the lower viscosity and small volumes handled, which makes upscale an easier process.