Identification of molecules and pathways regulating mistranslation in Candida albicans

Candida albicans is the major fungal pathogen in humans, causing diseases ranging from mild skin infections to severe systemic infections in immunocompromised individuals. The pathogenic nature of this organism is mostly due to its capacity to proliferate in numerous body sites and to its ability to adapt to drastic changes in the environment. Candida albicans exhibit a unique translational system, decoding the leucine-CUG codon ambiguously as leucine (3% of codons) and serine (97%) using a hybrid serine tRNA (tRNACAGSer). This tRNACAGSer is aminoacylated by two aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs): leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) and seryl-tRNA synthetase (SerRS). Previous studies showed that exposure of C. albicans to macrophages, oxidative, pH stress and antifungals increases Leu misincorporation levels from 3% to 15%, suggesting that C. albicans has the ability to regulate mistranslation levels in response to host defenses, antifungals and environmental stresses. Therefore, the hypothesis tested in this work is that Leu and Ser misincorporation at CUG codons is dependent upon competition between the LeuRS and SerRS for the tRNACAGSer. To test this hypothesis, levels of the SerRS and LeuRS were indirectly quantified under different physiological conditions, using a fluorescent reporter system that measures the activity of the respective promoters. Results suggest that an increase in Leu misincorporation at CUG codons is associated with an increase in LeuRS expression, with levels of SerRS being maintained. In the second part of the work, the objective was to identify putative regulators of SerRS and LeuRS expression. To accomplish this goal, C. albicans strains from a transcription factor knock-out collection were transformed with the fluorescent reporter system and expression of both aaRSs was quantified. Alterations in the LeuRS/SerRS expression of mutant strains compared to wild type strain allowed the identification of 5 transcription factors as possible regulators of expression of LeuRS and SerRS: ASH1, HAP2, HAP3, RTG3 and STB5. Globally, this work provides the first step to elucidate the molecular mechanism of regulation of mistranslation in C. albicans.

Candida albicans é o fungo patogénico mais predominante em humanos, causando doenças que podem variar entre ligeiras infeções de pele a infeções sistémicas severas em pacientes imunodeprimidos. A natureza patogénica deste organismo deve-se principalmente à capacidade de proliferação em vários locais do corpo humano e à sua capacidade de adaptação a mudanças drásticas no seu ambiente. Candida albicans exibe um sistema de tradução único, descodificando o codão de leucina CUG ambiguamente como leucina (3% dos codões) e serina (97%). Para tal usa um tRNA híbrido de serina (tRNACAGSer) que é aminoacilado por duas aminoaciltRNA sintetases (aaRSs): leucil-tRNA sintetase (LeuRS) e seril-tRNA sintetase (SerRS). Trabalhos anteriores mostraram que a exposição de C. albicans a macrófagos, stress oxidativo, pH e antifúngicos aumenta os níveis de ambiguidade de 3% a 15%, sugerindo que C. albicans tem a capacidade de regular os níveis de erros de tradução em resposta às defesas do hospedeiro, antifúngicos e stress ambiental. Desta forma, a hipótese testada neste trabalho é a de que a variável incorporação de Leu e Ser nos codões CUG é dependente da competição entre LeuRS e SerRS pelo tRNACAGSer. Para testar esta hipótese, os níveis de SerRS e LeuRS foram indiretamente quantificados em diferentes condições fisiológicas, usando um sistema repórter fluorescente que determina a atividade dos respetivos promotores. Os resultados sugerem que o aumento de incorporação de leucina em codões CUG está associado a um aumento da expressão de LeuRS, sendo mantidos os níveis de SerRS. Na segunda parte do trabalho, pretendeu-se identificar possíveis reguladores da expressão da SerRS e LeuRS. Para tal, uma coleção de estirpes de C. albicans com fatores de transcrição deletados foram transformadas com o sistema repórter fluorescente, de forma a quantificar a expressão das duas aaRSs. Alterações no rácio LeuRS/SerRS em estirpes deletadas relativamente à estirpe não deletada permitiram identificar 5 fatores de transcrição como possíveis reguladores da expressão destas duas aaRSs: ASH1, HAP2, HAP3, RTG3 e STB5. Globalmente, este trabalho constitui o primeiro passo para elucidar o mecanismo molecular de regulação de erros de tradução em C. albicans

Mestrado em Biologia Molecular e Celular