Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Protein synthesis fidelity is pivotal for proteome stability and cellular homeostasis. Even though normal physiologic conditions have an associated low protein synthesis error rate, this is frequently increased with aging and disease and the resulting protein misfolding is associated with various human diseases and aging processes. Importantly, gene mistranslations produced by tRNA misreading in the ribosome or tRNA mischarging by aminoacyl-tRNA synthetases cause neurodegenerative diseases in humans and mice. It is not yet clear how such diseases develop and whether they are a direct consequence of proteome disruption or a result of the toxicity produced by accumulation of mistranslated proteins. To elucidate how eukaryotic cells cope with protein misfolding and aggregation (proteotoxic stress) we have developed a strategy to destabilize the proteome in a regulated manner. We engineered transfer RNA (tRNAs) to misincorporate serine into proteins in zebrafish embryos. The mutant proteins misfold, trigger the unfolded protein response (UPR), up-regulate the ubiquitin proteasome pathway (UPP) and down-regulate protein synthesis. Proteotoxic stress generated by these gene mistranslations has strong effects on gene expression and miRNA profiles, embryo development and viability, increases the production of reactive oxygen species (ROS), accumulation of protein aggregates and mitochondrial dysfunction. Interestingly, embryo malformations and viability phenotypes could be reversed by ROS scavengers, suggesting that ROS play major roles in the cell degeneration phenotypes induced by protein misfolding and aggregation. We have also established a transgenic zebrafish line for proteotoxic stress studies. Hence, proteome mutagenesis by misreading tRNAs in zebrafish embryos is a powerful methodology to destabilize the proteome to study the biology of proteotoxic stress, it allows for controlled proteome aggregation and mimicking protein aggregation processes that occur naturally during aging and in human conformational diseases.

Doutoramento em Biologia