Toxicogenomics of natural and anthropogenic effectors in eleutheroembryos

The introduction of chemicals into the environment by human activities may represent a serious risk to environmental and human health. Environmental risk assessment requires the use of efficient and sensitive tools to determine the impact of contaminants on the ecosystems. The use of zebrafish for the toxicity assessment of pharmaceuticals, drugs, and pollutants, is becoming well accepted due to zebrafish unique advantages for the screening of compounds for hazard identification. The aim of the present work is to apply toxicogenomic approaches to identify novel biomarkers and uncovered potential modes of action of classic and emergent contaminants able to disrupt endocrine systems, such as the Retinoic Acid Receptor, Retinoid X Receptor and the Aryl Hydrocarbon Receptor. This study relies on different nuclear and cytosolic protein receptors and other conditional (ligand- or stress- activated) transcriptional factors that are intimately involved in the regulation of defensome genes and in mechanisms of chemical toxicity. The transcriptomic effects of organic compounds, endogenous compounds, and nanoparticles were analysed during the early stages of zebrafish development. Studying the gene expression profiles of exposed and unexposed organisms to pollutants using microarrays allowed the identification of specific gene markers and to establish a "genetic code" for the tested compounds. Changes in gene expression were observed at toxicant concentrations that did not cause morphological effects. Even at low toxicant concentrations, the observed changes in transcript levels were robust for some target genes. Microarray responses of selected genes were further complemented by the real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) methodology. The combination of bio-informatic, toxicological analyses of differential gene expression profiles, and biochemical and phenotypic responses across the treatments allowed the identification of uncovered potential mechanisms of action. In addition, this work provides an integrated set of tools that can be used to aid management-decision making by improving the predictive capability to measure environmental stress of contaminants in freshwater ecosystems. This study also illustrates the potential of zebrafish embryos for the systematic, large-scale analysis of chemical effects on developing vertebrates.

A introdução de compostos químicos no meio ambiente por atividades antropogénicas pode representar um sério risco para a saúde humana e ambiental. A avaliação de risco ambiental requer o uso de ferramentas eficientes e sensíveis para a determinação do impacto dos contaminantes nos ecossistemas. A utilização do peixe-zebra para a avaliação da toxicidade de produtos farmacêuticos, drogas e poluentes é bem aceite, devido às suas características únicas que permitem fazer o rastreio de poluentes e avaliar o seu risco. O principal objetivo deste trabalho consiste na aplicação de metodologias tóxico-genómicas para identificação de novos biomarcadores, e para a compreensão do modo de ação de contaminantes clássicos e emergentes, capazes de desregular o sistema endócrino (nomeadamente através do recetor do ácido retinóico, do recetor X retinoide e do recetor de hidrocarboneto de arilo). O estudo centraliza-se em diferentes recetores proteicos, nucleares, citosólicos e outros fatores de transcrição (ativados por ligandos ou por stressores) que estão intimamente envolvidos na regulação de genes do “defensoma” e de mecanismos de toxicidade química. Os efeitos transcriptómicos de compostos orgânicos, compostos endógenos e nano particulas foram analisados durante vários estadios de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Recorrendo à utilização de microarrays, os perfiles de expressão génica de organismos expostos e não expostos aos contaminantes foram estudados, o que permitiu a identificação de marcadores genéticos específicos, assim como o estabelecimento de um “código de genes” para os compostos estudados. As alterações na expressão génica foram observadas a concentrações que não causaram efeitos morfológicos. Inclusive a baixas concentrações, as alterações observadas no nível do transcriptoma, foram bastante robustas para alguns dos genes alvo. Para os genes selecionados os resultados dos microarrays foram posteriormente confirmados através da quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR). A combinação de ferramentas de bio-informática, de análises transcripcionais dos perfiles de expressão génica, e das respostas fenotípicas e bioquímicas para os diferentes tratamentos permitiram a identificação de potenciais mecanismos de ação. Além disto, este trabalho fornece um conjunto de ferramentas integradas que poderão auxiliar nas tomadas de decisão dos organismos de gestão, através da melhoria da capacidade preditiva para a determinação do stress ambiental induzido pelos contaminantes nos ecossistemas dulçaquícolas. Este estudo ilustra igualmente o potencial da utilização de embriões de peixe-zebra, para a análise sistemática e em larga escala dos efeitos de compostos químicos no desenvolvimento de vertebrados.

Doutoramento em biologia