Nucella lapillus: imposex transcriptome analysis and phenotypic plasticity

O conhecimento de mecanismos de genómica funcional tem sido maioritariamente adquirido pela utilização de organismos modelo que são mantidos em condições laboratoriais. Contudo, estes organismos não reflectem as respostas a alterações ambientais. Por outro lado, várias espécies, ecologicamente bem estudadas, reflectem bem as interacções entre genes e ambiente mas que, das quais não existem recursos genéticos disponíveis. O imposex, caracterizado pela superimposição de caracteres sexuais masculinos em fêmeas, é induzido pelo tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT) e representa um dos melhores exemplos de disrupção endócrina com causas antropogénicas no ambiente aquático. Com o intuito de elucidar as bases moleculares deste fenómeno, procedeu-se à combinação das metodologias de pirosequenciação (sequenciação 454 da Roche) e microarrays (Agilent 4*180K) de forma a contribuir para um melhor conhecimento desta interacção gene-ambiente no gastrópode Nucella lapillus, uma espécie sentinela para imposex. O trancriptoma de N. lapillus foi sequenciado, reconstruído e anotado e posteriormente utilizado para a produção de um “array” de nucleótidos. Este array foi então utilizado para explorar níveis de expressão génica em resposta à contaminação por TBT. Os resultados obtidos confirmaram as hipóteses anteriormente propostas (esteróidica, neuroendócrina, retinóica) e adicionalmente revelou a existência de potenciais novos mecanismos envolvidos no fenómeno imposex. Evidência para alvos moleculares de disrupção endócrina não relacionados com funções reprodutoras, tais como, sistema imunitário, apoptose e supressores de tumores, foram identificados. Apesar disso, tendo em conta a forte componente reprodutiva do imposex, esta componente funcional foi a mais explorada. Assim, factores de transcrição e receptores nucleares lipofílicos, funções mitocondriais e actividade de transporte celular envolvidos na diferenciação de géneros estão na base de potenciais novos mecanismos associados ao imposex em N. lapillus. Em particular, foi identificado como estando sobre-expresso, um possível homólogo do receptor nuclear “peroxisome proliferator-activated receptor gamma” (PPARγ), cuja função na indução de imposex foi confirmada experimentalmente in vivo após injecção dos animais com Rosiglitazone, um conhecido ligando de PPARγ em vertebrados. De uma forma geral, os resultados obtidos mostram que o fenómeno imposex é um mecanismo complexo, que possivelmente envolve a cascata de sinalização envolvendo o receptor retinoid X (RXR):PPARγ “heterodimer” que, até à data não foi descrito em invertebrados. Adicionalmente, os resultados obtidos apontam para alguma conservação de mecanismos de acção envolvidos na disrupção endócrina em invertebrados e vertebrados. Finalmente, a informação molecular produzida e as ferramentas moleculares desenvolvidas contribuem de forma significativa para um melhor conhecimento do fenómeno imposex e constituem importantes recursos para a continuação da investigação deste fenómeno e, adicionalmente, poderão vir a ser aplicadas no estudo de outras respostas a alterações ambientais usando N. lapillus como organismo modelo. Neste sentido, N. lapillus foi também utilizada para explorar a adaptação na morfologia da concha em resposta a alterações naturais induzidas por acção das ondas e pelo risco de predação por caranguejos. O contributo da componente genética, plástica e da sua interacção para a expressão fenotípica é crucial para compreender a evolução de caracteres adaptativos a ambientes heterogéneos. A contribuição destes factores na morfologia da concha de N. lapillus foi explorada recorrendo a transplantes recíprocos e experiências laboratoriais em ambiente comum (com e sem influência de predação) e complementada com análises genéticas, utilizando juvenis provenientes de locais representativos de costas expostas e abrigadas da acção das ondas. As populações estudadas são diferentes geneticamente mas possuem o mesmo cariótipo. Adicionalmente, análises morfométricas revelaram plasticidade da morfologia da concha em ambas as direcções dos transplantes recíprocos e também a retenção parcial, em ambiente comum, da forma da concha nos indivíduos da F2, indicando uma correlação positiva (co-gradiente) entre heritabilidade e plasticidade. A presença de estímulos de predação por caranguejos estimulou a produção de conchas com labros mais grossos, de forma mais evidente em animais recolhidos de costas expostas e também provocou alterações na forma da concha em animais desta proveniência. Estes dados sugerem contra-gradiente em alterações provocadas por predação na morfologia da concha, na produção de labros mais grossos e em níveis de crescimento. O estudo das interacções gene-ambiente descritas acima demonstram a actual possibilidade de produzir recursos e conhecimento genómico numa espécie bem caracterizada ecologicamente mas com limitada informação genómica. Estes recursos permitem um maior conhecimento biológico desta espécie e abrirão novas oportunidades de investigação, que até aqui seriam impossíveis de abordar.

Our understanding of functional genomic mechanisms is largely acquired from model organisms through laboratory conditions of exposure. Yet, these laboratory models typically have little environmental relevance. Conversely, there are numerous “ecological” model species that present important geneenvironment interactions, but lack genomic resources. Imposex, the superimposition of male sexual characteristics in females, is caused by tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) and provides among the most widely cited ecological examples of anthropogenically-induced endocrine disruption in aquatic ecosystems. To further elucidate the functional genomic basis of imposex, combinations of 454 Roche pyrosequencing and microarray technologies (Agilent 4*180K) were employed to elucidate the nature and extent of gene-environment interactions in the prosobranch gastropod, Nucella lapillus, a recognized sentinel for TBT-induced imposex. Following transcriptome characterization (de novo sequencing, assembly and annotation), microarray fabrication and competitive hybridizations, differential gene expression analyses provided support for previously suggested hypotheses underpinning imposex (steroid, neuroendocrine, retinoid), but also revealed potential new mechanisms. Evidence for endocrine disruption (ED) targets such as the immune system, apoptosis and tumour suppressors other than reproduction-related functions were found; however, given the ED nature of imposex, primary focus was on gender-differentiation pathways. Among these, transcription factors and lipophilic nuclear receptors as transducers of TBT toxicity along with mitochondrial functions and deregulation in transport activity suggested new putative mechanisms for the TBT-induced imposex in N. lapillus. Particularly, up-regulation of a putative nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) homolog was evident, and its role was further confirmed by inducing imposex in vivo using Rosiglizatone, a well-known vertebrate PPARγ ligand. Our analyses show that TBT-induced imposex is a complex mechanism, but is likely to act through the retinoid X receptor (RXR):PPARγ heterodimer signalling pathway, hitherto not described in invertebrates. Moreover, collectively, our findings support a commonality of signalling between invertebrate and vertebrate species that has previously been overlooked in the study of endocrine disruption. The genomic resources generated here largely contribute to the molecular understanding of imposex, yielding valuable insights for further examination of responses to TBT contamination exposure. Additionally, we anticipate that the new genomic resources described herein will contribute to the further exploration of adaptive responses of dogwhelks to environmental variation. N. lapillus was also used to explore adaptive shell shape morphology in response to natural variation in wave-action and crab predation. Knowledge of the contributions of genotype, plasticity and their interaction to phenotypic expression is crucial for understanding the evolution of adaptive character traits in heterogeneous environments. We assessed contributions of the above factors by reciprocal transplantation of snails between two shores differing in exposure to wave action and predation, and rearing snails of the same provenance in a laboratory common garden experiment with crab-predation odour, complemented by genetic analysis. The two target populations are genetically different but maintain the same karyotype. Truss-length and morphometric analyses revealed plasticity of shell shape in reciprocal transplants, but also the partial retention of parental shape by F2 snails in common garden controls, indicating co-gradient variation between heritable and plasticity components. Crab-predation odour influenced shell shape of snails from exposed-site origin and stimulated the production of thicker shell lips with greater response in snails of exposed-site ancestry. We interpret these data as countergradient variation on predator-induced changes in shell shape and increased thickening of the shell lip as well as on growth rates. The above exploration of gene-environment interactions demonstrates the feasibility, insights and novel opportunities that can now be addressed in a species that is well characterised ecologically, but hitherto constrained by the general lack of genomic tools and archived resources. Notably, a greater focus on detailed responses of a single species facilitates the comparative approach, as illustrated by the apparent commonality in regulation of endocrine disruption processes in invertebrates and vertebrates.

Doutoramento em Biologia

FCT; FSE - SFRH/BD/27711/2006

FSE

SFRH/BD/27711/2006