Expressão das proteínas da matriz na discondroplasia da tíbia

A discondroplasia da tíbia (TD) em aves consiste numa anomalia do esqueleto onde existe uma falha nos processos normais da ossificação endocondral. Esta patologia é caracterizada pela formação de uma cartilagem não vascularizada e não mineralizada que se estende até à metáfise. Uma vez que existem várias anomalias do esqueleto em mamíferos com lesões semelhantes às apresentadas pela TD, este trabalho teve como objectivo a caracterização desta patologia em termos das moléculas que podem estar envolvidas no seu desenvolvimento. Assim, foi estudada a expressão das macromoléculas da matriz extracelular, das enzimas degradadoras da matriz (metaloproteinases da matriz: MMPs), bem como das moléculas envolvidas na proliferação e diferenciação celular, na angiogénese e apoptose. A expressão génica foi realizada, por PCR quantitativo em tempo real, em placas de crescimento normais e discondroplásicas obtidas a partir de frangos de carne (broilers) da estirpe Cobb. Os níveis proteicos de algumas MMPs foram analisados por immunoblotting e zimografia de gelatina. No presente estudo não se verificou alteração na expressão dos genes dos colagénios do tipo II, IX, X e XI, bem como do agrecano, nas lesões discondroplásicas. Observou-se uma redução acentuada nos níveis de mRNA da gelatinase-B (MMP-9), da colagenase-3 (MMP-13) e das estromalisinas -2 (MMP-10) e -3 (MMP-11), bem como nos níveis proteicos da gelatinase-A (MMP-2) e da MMP-13. Por outro lado, a MMP-7 aumentou drasticamente a expressão do seu gene. As moléculas envolvidas na proliferação e diferenciação dos condrócitos, tais como a PTHrP, o Ihh, o Cbfa-1 e o Sox-9, mantiveram a sua expressão génica nas lesões. Por outro lado, o TGF-β reduziu a sua expressão. A caspase-3 também dimimuiu a sua expressão na patologia. Em relação aos factores angiogénicos, o FGF manteve a sua expressão e o VEGF aumentou significativamente nas lesões. Este aumento do VEGF juntamente com o aumento da MMP-7 sugere um aumento da hipoxia nas lesões. Os nossos resultados sugerem que a acumulação da cartilagem observada na discondroplasia é devida a uma diminuição da proteólise da matriz, resultado de uma sub-expressão das MMPs, e não de um aumento da produção das macromoléculas da matriz. Desta forma, os nossos resultados sugerem que a falha na expressão e/ou activação das MMPs poderá estar associada ao desenvolvimento da discondroplasia da tíbia em aves. Finalmente, os nossos resultados vêm suportar os resultados anteriores que sugerem uma ligação entre a expressão das MMPs e anomalias no processo de ossificação endocondral.

Avian tibial dyschondroplasia (TD) is a skeletal disease where the normal events of endochondral bone formation are disrupted. It is characterized by the formation of a lesion composed of nonvascularized and nonmineralized cartilage that can extend into the metaphysis. Because there are several mammalian skeletal diseases with lesions similar to TD, the present work aimed to characterize the disease in terms of the molecules that may be involved in its development. Thus, the expression of extracellular matrix (ECM) macromolecules, ECM-degrading enzymes (matrix metalloproteinases: MMPs), and the regulatory molecules involved in cell proliferation and differentiation, angiogenesis, and apoptosis, were studied. Gene expression was performed by real-time quantitative PCR in normal and TD-affected growth plates from 3- week-old broiler chicks (Cobb strain). The protein levels of some of the MMPs studied were analysed by immunoblotting and gelatin zymography. The collagen types II, IX, X, and XI as well as aggrecan did not change their gene expression in dyschondroplastic lesions. There was a pronounced reduction in the mRNA levels of gelatinase-B (MMP-9), collagenase-3 (MMP-13), and of stromelysins-2 (MMP-10) and -3 (MMP-11), as well as in the protein levels of gelatinase-A (MMP-2) and MMP-13. On the other hand, MMP-7 mRNA has increased significantly. The molecules involved in chondrocyte proliferation and differentiation, such as PTHrP, Ihh, Cbfa-1, and Sox-9 have maintained their mRNA levels in the pathology. On the other hand, TGF-β has decreased its gene expression. Caspase-3 also showed diminished mRNA levels in the pathology. Regarding the angiogenic factors, FGF has maintained its expression and VEGF has increased significantly in the lesions. The increment in VEGF in conjunction with the increased expression of MMP-7 suggests the formation of a hypoxic environment in the lesions. Our results suggest that the accumulated cartilage observed in dyschondroplasia seems to be the result of decreased matrix proteolysis due to the downregulation of MMPs and not to an increased production of the matrix macromolecules. Thus, our results suggest that the failure in the expression or lack in the activation of MMPs might be associated with the development of avian tibial dyschondroplasia. Furthermore, our results strengthen the link between the lack in MMP expression and abnormal endochondral bone formation.

Doutoramento em Biologia

FCT - SFRH/BD/6420/2001

SFRH/BD/6420/2001