Lichenicidin biosynthesis and search for novel antibacterial peptides

A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos, incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e 3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes.

Bacillus licheniformis I89 has the ability to produce some antibacterial compounds. In the present study, the separation of such compounds was achieved by the application of several procedures, including solid phase extraction and preparative high-pressure liquid chromatography. Two of these compounds constitute the class II lantibiotic lichenicidin and are characterized by the molecular masses of 3250 Da (Bliα) and 3020 Da (Bliβ). The lichenicidin gene cluster was successfully expressed in Escherichia coli, constituting the first report of a complete lantibiotic gene cluster heterologous expression in a Gram-negative host. This system was further exploited to characterize and assign the function of the proteins encoded in the biosynthetic gene cluster. Moreover, a trans complementation system was developed for the expression of Bliα and Bliβ mutants in vivo. The assignment of essential amino acid residues for bioactivity was investigated by generation of Ala-mutants. Also, several features of Bliα and Bliβ structures were revised by analysis of MS/MS fragmentation patterns obtained for wild type and mutated peptides. Regarding the lichenicidin self-protection in E. coli, it was found that immunity genetic determinants are not essential to Bliα and Bliβ production. Furthermore, it was experimentally confirmed that the E. coli outer membrane constitutes a natural barrier to the biological activity of lichenicidin. An intriguing feature of the lichenicidin production by E. coli lies in the export mechanism of Bliα and Bliβ peptides. Herein, it was demonstrated that the presence of these peptides in the E. coli supernatants resulted from their translocation through the bacterial cell wall. In fact, it was found that in the absence of the outer membrane protein TolC none of the lichenicidin peptides could be detected in the bacterial supernatants. The potential of the E. coli lichenicidin expression system to produce the closely related lantibiotic haloduracin through the biosynthetic processing of lichenicidin-haloduracin chimeras was also attempted in the present study, however, without success. It was found that under certain circumstances of incubation, B. licheniformis I89was able to differentiate from its parental rough phenotype to a more simple and smooth morphology. The differences in terms of growth, sporulation and antagonistic activity of both phenotypes were investigated in two different culture media. Regarding the production of lichenicidin peptides, it was found that the abundance of Bliα and Bliβ in extracts from the smooth phenotype cultivated in TSB was lower than that detected in the rough phenotype extracts. Finally, the screening of genetic elements associated with nonribosomal peptide synthetases was performed in Portuguese lagoons and soil from caves using a culture-independent approach. A wide variety of adenylation domains was identified, providing evidence that potentially novel NRPSs are present in these environments.

Doutoramento em Biologia

FCT - SFRH/BDE/15559/2005

Laboratório Medinfar SA