Protein phosphatases acting on the replication checkpoint

A génese de um cancro está dependente da acumulação de mutações genéticas que dão origem a instabilidade genómica, que por sua vez resulta na proliferação descontrolada. Para prevenir a acumulação destas mutações, as células têm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparação do ADN. Estes eventos são muitas vezes regulados por dinâmicas de (des)fosforilação de proteínas. As proteínas fosfatases (PPs), enzimas responsáveis pela remoção do grupo fosfato de resíduos fosforilados, desempenham funções cruciais na regulação de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no início do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicação estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas não eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicação, é exemplo dessa regulação por (des)fosforilação, como sejam nos resíduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulação do checkpoint da replicação, decidimos investigar o seu papel na regulação da fosforilação da Chk1. A primeira conclusão é que a desfosforilação da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinâmica bi-fásica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famílias PP1, PP2A e PP2C estão envolvidas na desfosforilação da Chk1. Uma vez que a família PP2A foi a que mostrou a maior acção nesta reacção, decidimos investigar outros membros da família in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown específico da PP4 e PP6 (através de siRNA). Os resultados mostram que a inibição das PPs afectam tanto a desfosforilação como o estado de activação da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a níveis diferentes, tanto a fosforilação como a desfosforilação da Chk1. A função das PPs foi também investigada ao nível: da regulação do disparo das origens de replicação, e da recuperação da suspensão da replicação, induzida pela HU. No último caso, os dados indicam que na situação simultânea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, há um atraso do ciclo celular na resolução da transição de G2/M. No ensaio de replicação por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expressão de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicação. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o início do checkpoint da replicação. Um rastreio de 2-híbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testículo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possíveis funções para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funções são sugeridas: a interacção com a GAGE12 sugere uma função na recombinação genómica/vigilância do genoma durante a meiose, e as interacções com a EEF1α1 e a RPS5 sugerem uma função na regulação da síntese proteíca. Estas experiências fornecem um visão geral para a compreensão da diversidade de funções das proteínas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicação, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.

The emergence of cancer is dependent on the accumulation of small numbers of genetic mutations that give rise to genomic instability, which in turn results in uncontrolled cell proliferation. To prevent the accumulation of such mutations and the evolution into a cancer state, cells operate checkpoints by arresting the cell cycle and triggering the DNA repair pathways. Often these events are regulated by protein (de)phosphorylation dynamics. Protein phosphatases (PPs), enzymes responsible for removing the phosphate from phosphorylated residues, play key roles in the regulation of many cellular mechanisms. While at the beginning of the project the kinases involved in the replication checkpoint were well established, PPs involved in the regulation of this pathway were not known. Chk1, a key component of the replication checkpoint machinery, is an example of regulation by (de)phosphorylation at several residues, such as Ser317 and Ser345. Hence, as a first approach to determine which PPs could be involved in the regulation of the replication checkpoint, we decided to investigate their role in the regulation of Chk1 phosphorylation state. The first finding from our study was that Chk1 dephosphorylation time course, both in vivo and in vitro, occurred with a bi-phasic dynamics. Secondly, a preliminary in vitro approach suggested that PP1, PP2A and PP2C families are involved in Chk1 dephosphorylation. Given that PP2A was shown to be the major contributor for this reaction, we investigated close family members in vivo, first by a general approach (either with OA treatment or PME-1 overexpression), and then by specific knockdown using siRNA for PP4 and PP6. Our data shows that besides affecting Chk1 dephosphorylation, the inhibition of PPs also affects Chk1 activation state in response to Hydroxyurea treatment. All the protein phosphatases tested in vivo seemed, to some extent, to be able to regulate either Chk1 phosphorylation or dephosphorylation. The PPs function was also investigated at the level of replication origin-firing regulation and the recovery from HU-induced replication arrest. In the latter study, our results indicate that PP4 knockdown triggers a HU-dependent cell cycle arrest in G2/M. In the pulse-chase replication assay, we show that OA treatment as well as I-2 or PME-1 overexpression, delay the timing of the normal replication origin-firing. None of the treatments performed seemed to abrogate the onset of the replication checkpoint. We have also performed a Yeast Two-hybrid screen in a human testis cDNA library using Chk1 as bait, in order to find novel interactors and identify new Chk1 putative functions in the context of meiosis. From this screen, two new Chk1 functions were defined due to the new putative interactions. Hence, the interaction with GAGE12 suggests a function in genomic recombination/ surveillance in meiosis and the interactions with both EEF1α1 and RPS5 suggest a function in protein synthesis regulation. These experiments provide a framework for understanding the diversity of the protein phosphatase functions involved in the replication checkpoint, as well as, for opening new avenues for the development of new drugs for cancer therapy.

Doutoramento em Biologia

FCT (POCI 2010) / FSE - SFRH/BD/11310/2002

SFRH/BD/11310/2002