Development and application of PNA probes for the detection of specific bacteria by FISH

Tese de doutoramento em Engenharia Biomédica

The gold standard for microbial detection, in clinical settings or in biofilm studies, is the culture method, which is time-consuming, technical demanding and can give inaccurate results. These limitations have driven scientist to the development of new molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH). This technique has been combined with peptide nucleic acid (PNA) molecules, allowing a faster and specific detection of microorganism. In this work, we attempted to evaluate this technology on the detection of relevant bacterial pathogens on food and clinical samples, and on the characterization of multi-species biofilms. As such, the first goal of this thesis was to design, optimize and test for specificity and sensitivity, three new PNA probes to detect Cronobacter spp., Salmonella spp. and Proteus spp. in different samples. Afterwards, the PNA FISH method was compared with the standard methods used to analyze each type of sample. Cronobacter spp. are clinically relevant bacteria because they can cause infections in new-born infants manly due to the consumption of contaminated powdered infant formula (PIF). A PNA probe for the rapid detection of Cronobacter species in PIF was developed and showed experimental specificity and sensitivity both of 100%. Salmonella spp. are well known enteropathogenic bacteria that cause diseases ranging from a mild gastroenteritis to septicaemia, and infection usually occurs due to the consumption of contaminated products. The Salmonella probe was applied to artificially contaminated samples (powdered infant formula and blood) and to natural samples (water and faeces) and probe testing showed specificity and sensitivity values of 100 and 97,6%, respectively. Proteus species are related with the emergence of complicated urinary tract infection (UTI) mainly for catheterized patients (catheter associated UTI’s *CAUTI’s+), which are the most common nosocomial infection. The PNA probe developed for Proteus spp. detection in urine samples showed experimental specificity and sensitivity both of 100%. Regarding the total time required to obtain the results, considering a preenrichment step before the PNA FISH application, this method allowed detection in less than 20 hours for Salmonella spp. and less than 12 hours for Cronobacter spp., even for detection levels of 1 CFU per 10 g or ml and when the target bacteria are outnumbered by other microorganisms. Comparing to the corresponding standard procedures, this represented time savings for both microorganisms of at least 3 days. For Proteus spp. detection, as an enrichment step is not needed, the PNA FISH method was able to detect in approximately 2 hours, as low as 1×104 CFU/mL (a concentration considered indicative of infection for CAUTI’s), which represents time saving of at least 24 hours. The second main goal of this work was to evaluate the PNA FISH performance, using a multiplex approach, on mixed biofilm samples. As such, the PNA FISH method was applied to the characterization of Salmonella enterica/ Listeria monocytogenes/Escherichia coli single, dual and tri-species biofilms in seven different support materials. Results showed that PNA FISH can bring important information not accessed by the other established techniques (culture and crystal violet) especially regarding the spatial distribution (when combined with confocal laser scanning microscopy) and viable but non cultivable stages. Moreover, the PNA FISH data in combination with data from other established techniques, allowed the development of a model for the tri-species biofilm. It was observed that the higher growth rate and exopolysacharide production ability of E. coli led this microorganism to outcompete the other two species resulting on two well defined layers: the top one only with E. coli, and the bottom one with mixed regions of L. monocytogenes and S. enterica. Our results indicate that PNA FISH could be a reliable alternative or complement to the currently used culture-based techniques as it is a very sensitive, specific and rapid method for the detection and location of specific microorganisms. It can be adapted with little effort to different types of samples, even using multiplex approaches, and to microorganisms with different cell wall properties. Finally, it was also demonstrated that PNA FISH is powerful tool for the characterization of multi-species biofilms and that its application can bring important information about inter-species interactions within these structures.

O método padrão para detecção de microrganismos, em ambiente clínico ou no estudo de biofilmes, é o método de cultura, que é demorado, exige técnica e pode levar a resultados ambíguos. Estas limitações levaram os investigadores a desenvolver novas técnicas moleculares como a hibridação fluorescente in situ (FISH). Esta técnica tem sido combinada com moléculas de ácido peptido nucléico (PNA), permitindo uma detecção rápida e específica dos microrganismos alvo. Neste trabalho, procurou-se avaliar a tecnologia de PNA FISH na detecção de bactérias patogénicas em alimentos e amostras clínicas, assim como na caracterização de biofilmes mistos. Como tal, o primeiro objectivo desta tese foi o desenho, optimização e teste de sensibilidade e especificidade de três novas sondas de PNA para detectar Cronobacter spp., Salmonella spp. e Proteus spp., em diferentes amostras. Seguidamente, o método de PNA FISH foi comparado com os métodos padrão usados na análise de cada tipo de amostra. Cronobacter spp. é um género importante a nível clínico porque pode provocar infecções em recém-nascidos. A infecção está geralmente associada ao consumo de fórmulas infantis em pó (PIF) contaminadas. Neste sentido, foi desenvolvida uma sonda de PNA para a detecção rápida de Cronobacter spp. em amostras de PIF, que mostrou valores experimentais de especificidade e sensibilidade de 100%. Salmonella spp. é um género de bactérias enteropatogénicas que causa doenças que vão desde a gastroenterite leve a septicemia. A infecção geralmente ocorre devido ao consumo de produtos contaminados. A sonda de PNA desenvolvida para Salmonella spp. foi aplicada em amostras artificialmente contaminadas (PIF e sangue) e em amostras naturais (água e fezes), e mostrou valores de especificidade e sensibilidade de 100 e 97,6%, respectivamente. As espécies de Proteus estão relacionadas com o aparecimento de infecção do tracto urinário (UTI) complicadas, principalmente em pacientes cateterizados (UTI's associadas a cateteres [CAUTI]), que são as infecções nosocomiais mais comuns. A sonda de PNA desenvolvida para a detecção de Proteus spp. em amostras de urina apresentou especificidade e sensibilidade experimentais, ambas de 100%. Relativamente ao tempo total necessário para obter os resultados da análise por PNA FISH, mesmo considerando um passo de pré-enriquecimento antes da aplicação da técnica, este método permite detectar Salmonella spp. em menos de 20 horas e Cronobacter spp. em menos de 12 horas mesmo para níveis de detecção de 1 UFC por 10 g ou ml de amostra e quando as bactérias alvo estão em concentração muito inferior aos restantes microrganismos. Comparando com os procedimentos padrão correspondentes, esta técnica representa uma poupança de pelo menos três dias para os dois grupos de microrganismos. Para a detecção de Proteus spp., como uma etapa de enriquecimento não é necessária, o método de PNA FISH foi capaz de detectar, em aproximadamente duas horas, 1 × 104 UFC / mL (uma concentração considerada indicativa de infecção para CAUTI’s), o que representa economia de tempo de pelo menos 24 horas. O segundo objectivo deste trabalho foi avaliar o desempenho PNA FISH, utilizando uma abordagem “multiplex” (várias sondas em simultâneo), em amostras de biofilmes mistos. Para tal, o método de PNA FISH foi aplicado na caracterização de amostras de biofilmes simples e mistos, com duas e três espécies, de Salmonella enterica / Listeria monocytogenes / Escherichia coli, em sete materiais diferentes. Os resultados mostraram que a técnica de PNA FISH pode trazer informações importantes que não são acessíveis às outras técnicas já estabelecidas (cultura e violeta de cristal), especialmente no que diz respeito à distribuição espacial (quando combinado com microscopia confocal de varrimento laser) e estados viáveis mas não cultiváveis. Além disso, a combinação dos dados de PNA FISH com dados de violeta de cristal e cultura permitiu o desenvolvimento de um modelo para o biofilme de três espécies. Foi observado que a taxa de crescimento e a elevada capacidade de produção exopolissacarídeos de E. coli permitiu que a concentração deste microrganismo ultrapassasse as restantes espécies resultando em duas camadas bem definidas: a superior só com E. coli, e a camada inferior com regiões mistas de L. monocytogenes e S. Enteritidis. Estes resultados indicam que o método de PNA FISH pode ser uma alternativa viável e/ou complementar às técnicas de cultura actualmente utilizadas, pois é um método muito sensível, específico e rápido na detecção microbiológica. Além disso, pode ser facilmente adaptado a diferentes tipos de amostras, mesmo usando abordagens “multiplex” e para microrganismos com diferentes propriedades de parede celular. Finalmente, foi também demonstrado que o PNA FISH é uma ferramenta poderosa para a caracterização de biofilmes mistos e que a aplicação pode trazer informações importantes sobre as interacções inter-espécies.