Estudo da suscetibilidade aos antibióticos em isolados de Enterobacteriaceae provenientes de suiniculturas Portuguesas

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

O reconhecimento da resistência antimicrobiana como um fenómeno emergente em saúde pública, tem constituído um problema a nível mundial. A comunidade científica constatou a necessidade de realizar a avaliação da suscetibilidade aos antibióticos em “bactérias indicadoras” de diversas origens, como uma medida para combater o aumento da resistência antimicrobiana. As bactérias comensais Escherichia coli são colonizadoras do trato gastrintestinal da maioria dos animais e humanos permitindo realizar estudos de emergência, ocorrência e disseminação da resistência aos antibióticos. Em Portugal, a maioria dos estudos centra-se na pesquisa de ESBLs em Enterobacteriaceae provenientes das fezes de animais para consumo humano, existindo poucos estudos desenvolvidos sobre a avaliação dos perfis de suscetibilidade em Enterobacteriaceae provenientes de diferentes tipos de amostras de suiniculturas (rações, animais, águas, esgotos), assim como sobre a ocorrência de ESBLs e a análise da estrutura populacional de Enterobacteriaceae neste nicho. O presente estudo tem como objetivos: (i) testar a suscetibilidade a vários antibióticos em Enterobacteriaceae provenientes de suínos e de diversos ambientes de suiniculturas Portuguesas, (ii) detetar a ocorrência de Enterobacteriaceae produtoras de ESBLs em suiniculturas Portuguesas e (iii) analisar a estrutura populacional de Escherichia coli provenientes de suínos e de diversos ambientes de suiniculturas Portuguesas. Foram analisadas amostras provenientes de cinco suiniculturas Portuguesas distribuídas pela região Norte, Centro e Sul do país. Após pré-enriquecimento, as amostras foram inoculadas em meios de agar MacConkey com ou sem antibióticos. Os diferentes morfotipos foram identificados presuntivamente através da realização da coloração de Gram, teste de oxidase e fermentação da glucose e também por técnicas de biologia molecular, nomeadamente PCR. Foi feito o estudo da estrutura populacional de E. coli pela determinação dos grupos filogenéticos e testada a suscetibilidade a vinte e três antibióticos utilizando o método de difusão em agar. A deteção da produção de beta-lactamases de espetro alargado foi efetuada através do teste do duplo sinergismo (DDST). De um modo geral, os grupos filogenéticos com maior frequência foram o A1 (54%, 59/110), o A0 (22%, 24/110) e o B1 (21%, 23/110). Os grupos com menor frequência foram o D1 (3%, 3/110) e o D2 (1%, 1/110). Relativamente ao grupo B2 não se verificou a presença de isolados pertencentes a este grupo. Os antibióticos não beta-lactâmicos para os quais se observou uma maior frequência de resistência foram as tetraciclinas (84%, 146/174), a estreptomicina (75%, 130/174), as sulfonamidas (73%,127/174), o trimetoprim (72%, 125/174), e a espectinomicina (56%, 98/174). Entre os antibióticos beta-lactâmicos a maior taxa de resistência foi observada para a amoxicilina e ácido clavulânico (16%, 28/174) cefotaxima (15%, 26/174) e a cefoxitina (13%, 23/174). Detetou-se a produção de beta-lactamases de espectro alargado em 14% (25/174) dos isolados testados.A elevada ocorrência de resistência a antibióticos nas Enterobacteriaceae testadas é preocupante, uma vez que bactérias resistentes a antibióticos e/ou os seus genes de resistência poder-se-ão disseminar no ambiente ou atingir o Homem através da cadeia alimentar, constituindo uma importante ameaça para a saúde pública. Recognition of antimicrobial resistance as an emerging phenomenon in public health has been a worldwide problem. The scientific community has found the need for assessing susceptibility to antibiotics in "indicator bacteria" from various sources as a measure to combat increasing antimicrobial resistance. Commensal Escherichia coli bacteria colonize the gastrointestinal tract of most animals and human, allowing the study of the emergency, occurrence and spread of antibiotic resistance. In Portugal, most studies focuses on the research of ESBLs in Enterobacteriaceae from the feces of animals for human consumption. However, there are only few studies conducted on the evaluation of susceptibility profiles in Enterobacteriaceae from different types of samples of pig farms (feed, animals, water, sewage), on the occurrence of ESBLs and on the analysis of the population structure of this niche. The present study aims to: (i) test the susceptibility to various antibiotics in Enterobacteriaceae, from pigs and pig farms from Portuguese diverse environments, (ii) detect the occurrence of ESBLproducing Enterobacteriaceae in Portuguese pig farms and (iii) analyze the structure of the population of Escherichia coli from pigs and pig farms from Portuguese diverse environments. We analyzed samples from five Portuguese pig farms distributed by the North, Centre and South. After pre-enrichment, samples were inoculated onto MacConkey agar media with or without antibiotics. The different morphotypes were presumptively identified by performing Gram staining, oxidase test and glucose fermentation and also by molecular biology techniques, including PCR. The study of the population structure of E. coli was made by determining the phylogenetic groups and the susceptibility to twenty three antibiotics was tested using the agar diffusion method. Detection of beta- lactamases production of extended spectrum was performed by testing the double synergism (DDST). In general, the most frequent phylogenetic groups were A1 (54%, 59 /110), A0 (22%, 24 /110) and B1 (21%, 23 /110). Otherwise, the less frequent groups were D1 (3%, 3/ 110) and D2 (1%, 1 /110). There was no evidence of the presence of strains belonging to the group B2. The non-beta-lactam antibiotics for which we observed a higher frequency of resistance were tetracycline (84%, 146/174), streptomycin (75%, 130/174), sulfonamides (73%, 127/174) trimethoprim (72%, 125/ 174) and spectinomycin (56%, 98 /174). Among the betalactam antibiotics the highest rate of resistance was observed for amoxicillin and clavulanic acid (16%, 28/174) cefotaxime (15%, 26/174) and cefoxitin (13%, 23/174). The production of broad sprectrum beta- lactamase was verified in 14% (25 /174) of the isolates tested. The high incidence of antibiotic resistance in the tested Enterobacteriaceae is worrying, since antibiotic resistant bacteria and/or their resistance genes will be able to spread in the environment or achieving man through the food chain, constituting a major threat to public health.