二种抗HIV-1 药物筛选模型的建立及β-咔啉类化合物抗HIV 活性研究

艾滋病的流行严重威胁着人类健康和全球经济的发展，在某些国家已经造成 严重的经济问题和社会问题。由于尚无安全有效的艾滋病疫苗问世，药物治疗仍 是目前防治艾滋病的主要途径。二十多种抗HIV 药物的临床使用以及HAART 疗 法的应用，艾滋病患者的死亡率呈一定的下降趋势。然而，目前使用的抗HIV 药物能够抑制患者体内病毒的复制，但不能完全清除病毒。耐药病毒株的出现和 流行更降低了药物治疗的成功率。为此需要不断研究开发作用于新靶点或具有不 同作用机制的药物。 药物筛选是药物开发中的重要环节，其关键在于建立适合的药物筛选方法。 传统药物筛选费时费力，近年来逐渐被高通量药物筛选方法所代替。本研究中， 我们在大肠杆菌中表达并纯化了HIV-1 蛋白酶，获得了纯度和活性较高的蛋白 酶。利用荧光标记的蛋白酶底物在体外检测化合物对蛋白酶活性的影响，建立了 适于高通量筛选蛋白酶抑制剂的体外筛选方法。通过对大量样本的筛选，发现一 些具有蛋白酶抑制活性的化合物和粗提物。本研究还表达纯化了HIV-1 核衣壳蛋 白NCp7。利用锌离子特异性的荧光染料，建立了相应的高通量筛选方法。该方 法能够筛选出通过逐出NCp7 结合的锌离子而抑制该蛋白功能的化合物。这两种 体外筛选方法的建立大大提高了药物筛选的效率，降低了工作强度，为进一步的 研究打下了基础。 在药物开发过程中，常常通过对已知有效的化合物进行结构修饰以提高药物 活性并降低细胞毒性，改善药物疗效。在先前的药物筛选中，我们发现从高等真 菌中提取的β-咔啉类化合物flazin, 具有一定的抗HIV 活性。通过对flazin 的结 构修饰， 我们发现了治疗指数更高的化合物。本研究对其中两个， dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide，进行了更深入的抗HIV 活性研究。 dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 抑制HIV-1IIIB 感染诱导的合胞体形 成的EC50 分别为0.31 μM 和 0.38 μM。 与flazin(EC50 为2.37 μM）相比较， 抗HIV 活性提高了约6-7 倍。这两个化合物对C8166 细胞的半致死浓度(CC50) 分别为27.34μM和118.64μM。Dehydroxymethylflazinamide 的细胞毒性与flazin (CC50 为28.71μM）相似，而flazinamide 的细胞毒性降低了约4 倍左右。与flazin 相比，通过结构修饰，Dehydroxymethylflazinamide 治疗指数从12.1 提高到 88.19，而flazinamide 治疗指数从12.1 提高到312.2。研究还发现，这两个化 合物对临床分离株HIV-1KM018 以及实验株HIV-2ROD、HIV-2CBL-20 也有良好的抑 制效果。 我们对dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 的作用机制也进行了初 步探讨。二者均能有效抑制HIV-1IIIB, HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 病毒的细胞间传 播，而不能抑制HIV-1IIB 慢性感染的H9 细胞中病毒复制，说明该化合物可能主 要作用于病毒生活周期的早期阶段； 进一步的研究表明， dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1IIIB 进入阶段有很强的抑制活性，说明进入 阶段是该化合物的主要作用靶点；而flazinamide 对直接杀病毒、病毒吸附及进 入均没有显著的抑制效果，该化合物的作用机制还需进一步研究。对酶靶点作用 研究表明，两个化合物对HIV-1 逆转录酶仅有微弱抑制活性说明该酶可能不是作 用靶点；dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1 蛋白酶有抑制活性但半效浓度 （EC50）较高,说明该酶可能是化合物的次要靶点。而flazinamide 在体外与重组 的整合酶有较强的结合活性，暗示该化合物可能对整合酶有一定的抑制作用。以 上结果还说明，虽然两个化合物具有类似的结构，但它们可能是通过完全不同的 机制来抑制HIV 的复制.