ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

To ascertain the role of ExoU in airway inflammatory response, human bronchial epithelial cells from the BEAS-2B line were treated with radiolabeled AA and then infected with the ExoU-producing P. aeruginosa PA103 strain, and with the mutants PA103ΔexoU (with deletion of the gene exoU), PA103ΔUT/exoU (with deletion of exoU and complementation with the functional gene) and PA103ΔUT/S142A (with deletion of exoU and complementation with a gene with specific site mutagenesis in the enzyme catalytic domain). After 1h, the release of AA by cells infected with the ExoU-producing strains was significantly higher than the release by control cells and by cells infected with the ExoU deficient mutants. Bacterial treatment with MAFP, an inhibitor of PLA2, inhibited significantly the AA release. Cells infected with PA103 and PA103ΔUT/exoU secreted PGE2 and LTB4 in concentrations significantly higher than cells infected with the other bacterial strains and control non-infected cells. MAFP treatment inhibited significantly the release of PGE2. The flow cytometric analysis of infected and non-infected cells exposed to an anti-COX-2 antibody revealed that the percentage of PA103-infected cells labeled by the antibody was significantly higher than the percentage of labeled cells in control cultures but was similar to the percentage of labeled cells in cultures infected with the ExoU-deficient bacteria. Cell treatment with NS 398, a specific inhibitor of COX-2, resulted in a significant inhibition of PGE2 secretion by PA103-infected cells, but not by PA103ΔUT/exoU-infected cells or by control cells. Lipid bodies (LB) are cytoplasmic domains enriched in COX-2 and other enzymes implicated in the metabolismo of AA that can be induced by different stimuli, including bacterial LPS and AA. Since PA103-infected cells released high concentrations of free AA, we wondered whether the increased release of eicosanoids by these cells may have resulted from an AA-induced increase in LB numbers. To address this question, infected and non-infected cells were exposed to a lipophylic probe that labels LB. Flow cytometric showed that the percentage of labeled cells in cultures infected with the ExoU-producing bacteria was significantly lower than the percentage in control cultures or in cultures infected with the ExoU-deficient bacteria. MAFP treatment inhibited significantly the reduction of the labeling of PA103-infected cultures. Flow cytometric analysis of cultures exposed to the lypophylic probe and to an anti-PGE2 antibody showed, in PA103-infected cultures, the simultaneous reduction in cell labeling with the probe and the increase in the labeling with the anti-PGE2 antibody. Based in these results we speculate that in cultures infected with the ExoU-producing bacteria, the toxin may have metabolysed LB glycerophospholipids, leading both to a reduction in its affinity for the probe and to a local PGE2 synthesis.