A Tenascina-C e a sinalização celular na diferenciação tubulogênica endotelial

A matriz extracelular (MEC) é capaz de modular a adesão celular, induzindo processos de sinalização celular. No estado de aderência intermediária, induzido por proteínas matricelulares, as células tendem a se diferenciar, migrar e proliferar. A tenascina-C é uma proteína matricelular amplamente secretada em gliomas que está envolvida na proliferação e angiogênese tumoral. A MEC de gliomas, possui elevada incorporação de tenascina-C (TN-C), uma glicoproteína matricelular desadesiva que compete com a glicoproteína adesiva fibronectina (FN), desestabilizando os contatos focais e induzindo proliferação celular em gliomas. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o papel da TN-C tumoral no fenótipo angiogênico de células endoteliais. Recentemente em um trabalho publicado pelo nosso grupo observamos que as células endoteliais semeadas sobre matrizes de glioma (U373 MG) aderem menos e são deficientes na capacidade de formar tubos quando comparadas com àquelas plaqueadas sobre MEC de HUVECs. No entanto, neste trabalho, reproduzimos este fenótipo semeando as células endoteliais em suportes de TN-C /FN miméticos da composição da matriz tumoral nativa. Por western blotting, observamos um aumento na fosforilação em treonina 638 da proteína PKCα, um possível sítio inibitório, e um aumento na ativação de PKCδ. O efeito antagônico na regulação dessas isoformas de PKC foi demonstrado quando usamos inibidores seletivos de PKC α e δ e um ativador de PKCα (PMA). Observamos que quando tratamos as HUVECs plaqueadas sobre MEC de U373 com PMA, resgatamos a capacidade dessas células de formar tubos, o pré-tratamento dessas HUVECs com inibidor de PKC δ (rotlerina) resgatou parcialmente a capacidade tubulogênica dessas células. O pré-tratamento das HUVECs que foram semeadas sobre MEC da HUVEC (que formam tubos normalmente) com um inibidor de PKC α (RO320432) levou a diminuição da capacidade tubulogênica. Além disso, esta matriz também induz ativação de ERK e AKT. Investigamos também se o bloqueio dos diferentes domínios da TN-C na matriz derivada de glioma poderia, de alguma forma, reverter o defeito angiogênico das células, propiciado pela interação com a matriz extracelular de gliomas. O pré-tratamento da matriz extracelular de glioma com anticorpos anti-TN-C (contra os domínios FNIII 1-3, 4-5 FNIII e N-terminal) resgatou parcialmente a capacidade das células endoteliais de formar tubos. Nossos dados sugerem que a indução do fenótipo vascular observado em muitos gliomas, com predomínio de vasos mal formados e sub-funcionais, pode ser parcialmente devido ao comprometido da sinalização mediada por PKCs em células endoteliais, bem como do aumento da ativação das vias de ERK e Akt.

The extracellular matrix (ECM) modulates both strong cell adhesion by inducing junctional complexes - and intermediate states of adhesion, where cells can differentiate, migrate and proliferate, depending on the signaling pathways activated by adhesion receptors. Tenascin-C is a matricellular protein widely secreted by glioma cells. It has a significant anti-adhesive activity and is involved in proliferation and tumor angiogenesis. Alves et al., 2011 observed that endothelial cells seeded on ECM of the U373 adhere less and are deficient in the ability to form tubes when compared with those plated on ECM of the HUVECs. This phenotype was reproducible with substrates for TN-C/FN mimetic of native tumor matrix composition. We also investigated whether the blockage of different domains of TN-C in glioma-derived matrix could revert this poor angiogenic phenotype. Pre-treatment of glioma-derived matrix with antibodies against FNIII-type 1-3 repeats, FNIII-type 4-5 repeats and the EGF-like N-terminal domain of TN-C partially rescued endothelial cell ability to form tubes. PKC-alpha activation has been previously implicated in the induction of tubulogenesis in Matrigel. By western blotting, we observed an increase in the phosphorylation of a threonin 638 - a possible inhibitory site PKC alpha protein - and in the threonine 505 of PKC delta leading to its inactivation - in tubulogenesis-defective endothelial cells previously incubated with ECM of gliomas. The antagonistic effect of these isoforms of PKC was demonstrated when we used selective inhibitors and activators of the PKCs. When HUVECs were incubated with ECM U373 MG in the presence of PMA, they rescued their ability to form tubes; pre-treatment of HUVECs with inhibitor of PKC δ (rottlerin) also partially rescued the tubulogenic ability of these cells. However, pre-treatment of HUVECs were seeded on the HUVEC ECM (which form tubes normally) with an inhibitor of PKC α (RO320432) led to impairment of tubulogenesis. Moreover, this matrix also induces activation of ERK and AKT. Our data suggest a role for TN-C-induced aberrant vascular phenotypes often observed in malignant gliomas can have the possible contribution of PKC-alpha inhibition, as well as of ERK and Akt activation, in endothelial cells exposed to tumor ECM.