Perfil genético por sequenciamento e genotipagem de cepas multirresistentes do <i>Mycobacterium tuberculosis</i> provenientes de diversos estados brasileiros

A tuberculose multirresistente (MR) a drogas é uma séria ameaça à saúde pública devido à maiores complexidade, custo e efeitos colaterais do tratamento. Poucos estudos descreveram a epidemiologia molecular de isolados de <i>Mycobacterium tuberculosis</i> MR no Brasil. Neste trabalho foi investigada a diversidade genética e mutações associadas à resistência a drogas de 99 isolados MR e 7 não MR coletados em um período de 8 anos e provenientes de 12 estados brasileiros. Esta investigação foi feita através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do elemento de inserção IS6110 (IS6110-RFLP), spoligotyping e sequenciamento de regiões dos genes rpoB e katG que conferem resistência aos antibióticos rifampicina e isoniazida, respectivamente. Mutações nos genes katG e rpoB foram encontradas em 90,9% e 93% dos isolados MR analisados, respectivamente. Para o gene rpoB, 91,9% das mutações estavam contidas na região RRDR de 81-pb. Um total de 51 (51.5%), 23 (23.3%) e 11 (11.1%) isolados MR apresentaram mutações nos códons 531, 526 e 516, respectivamente. Com relação ao gene katG, foram encontradas mutações em 93% dos isolados MR analisados, sendo que 7 apresentaram mutações apenas na primeira região analisada (katG1). O codon 315 da segunda região analisada do gene katG (katG2) apresentou mutações em 82.8% dos isolados MR, sendo a maioria Ser315Thr. A região katG1 apresentou mutações em 30.3% dos isolados MR sendo a maioria deleção do códon 4. Pelo spoligotyping foi possível determinar que os isolados MR deste estudo pertencem a 5 diferentes famílias (com suas subfamílias) de M. tuberculosis circulantes no Brasil, onde as mais frequentemente encontradas foram: LAM (46%), T (17%) e H (12%). Nós observamos que uma das famílias, a EAI5, carrega mutações no códon 463 do gene katG, o que não ocorre para as demais. Além disso, entre nossos isolados foi identificada um isolado pertencente à cepa Beijing (extremamente virulenta), mas este fato não é alarmante já que se tratou de apenas um caso. Através de nossos dados foram descritos novos alelos mutados para os genes rpoB e katG. Com exceção da família X2, foi identificada uma região inicial do gene katG com alta frequência de mutações nos isolados MR. A análise por IS6110-RFLP revelou que 25 isolados formaram 11 grupos genotípicos enquanto 74 mostraram um padrão único de bandas. Esta alta taxa de polimorfismo indica aquisição independente de resistência entre nossos isolados. Para a família H, foi identificada uma inversão na freqüência de ocorrência de mutações no gene rpoB, sendo o códon 516 o mais mutado, seguido pelo 526 e 531. Os resultados deste estudo fornecem informações úteis para um melhor entendimento do espectro de mutações dos isolados MR de pacientes no Brasil. Nossos resultados também se tornam úteis no desenvolvimento de testes diagnósticos de tuberculose MR e para auxiliar no rastreamento da transmissão global desta doença.

Multidrug resistant (MR) tuberculosis is a major threat to public health due to the greater complexity, cost and side effects of treatment. Few studies have described the molecular epidemiology of MR <i>Mycobacterium tuberculosis</i> isolates in Brazil. In this study, we investigated the genetic diversity and mutations associated with drug resistance of 99 MR and 7 non-MR isolates collected in a 8-year period from 12 Brazilian states. This investigation was performed by restriction fragment length polymorphism analysis of the IS6110 insertion element (IS6110-RFLP), spoligotyping and sequencing of the rpoB and katG genes that, when mutated, confer resistance to isoniazid and rifampin, respectively. Mutations in rpoB and katG were found in 90.9% and 93% of the MR isolates analyzed, respectively. For the rpoB gene, 91.9% of the mutations were found in the 81-bp RRDR region Fifty-one (51.5%), 23 (23.3%) and 11 (11.1%) MR isolates had mutations in codons 531, 526 and 516, respectively. In the katG gene, mutations were found in 93% of the MR isolates analyzed. Seven isolates had mutations only in the first region analyzed (katG1). Codon 315 of the second katG gene region analyzed (katG2) had mutations in 82.8% of the MR isolates, mostly being a Ser315Thr substitution. Mutations were found in 30.3% of the MR isolates in the katG1 region and the majority was a codon 4 deletion. Spoligotyping detected 5 different M. tuberculosis families (with their subfamilies) in the MR isolates in this study. The most common were: LAM (46%), T (17%) and H (12%). We observed that one of the families, the EAI5, carries mutations in codon 463 of the katG gene, which does not occur for the other isolates. In addition, among our isolates we identified an isolate belonging to the Beijing family (highly virulent), but this fact is not alarming since this was only one case. We described new alleles for the rpoB and katG genes. With the exception of the X2 family, we identified an initial region of the katG gene with high frequency of mutations in the MR isolates. IS6110-RFLP analysis demonstrated that 25 isolates formed 11 genotypic groups while 74 showed a unique pattern of bands. This high rate of polymorphism indicates independent acquisition of resistance among our isolates. Concerning the H family, an inversion in the frequency of mutations occurred in the rpoB gene with codon 516 being the most mutated one followed by codons 526 and 531. The results of this study provide useful data for better understanding the spectrum of mutations of the MR isolates from patients in Brazil. Our results are also useful for the development of diagnostic tests for MR tuberculosis and to aid in tracking global transmission of this disease.