Bases moleculares da multiresistência a drogas em <i>Mycobacterium tuberculosis</i>

A tuberculose (Tb) é a principal causa de morte no mundo, por um agente infeccioso. O tratamento padrão é a quimioterapia: rifampicina (RMP), isoniazida (INH) e pirazinamida (PZA). O maior problema global da Tb é o aumento de cepas multirresistentes (resistência pelo menos à INH e à RMP) do <i>Mycobacterium tuberculosis</i> (MTb). A resistência à INH e RMP ocorre geralmente por mutação genética nos genes KatG e rpoB, respectivamente. Os objetivos deste trabalho foram: 1. Analisar os tipos e freqüências de mutações em duas regiões iniciais do gene katG do MTb. 2. Determinar os tipos e freqüências das mutações no gene rpoB. Duas regiões do gene katG e uma do gene rpoB foram amplificadas por PCR e seqüenciadas para o diagnóstico das mutações. Para a análise do gene katG foram utilizadas 101 cepas. Dentre estas, 4 eram sensíveis e não apresentaram mutação (controle). Das 97 cepas restantes, na primeira região seqüenciada do KatG, não ocorreram mutações em 67. Nas outras 30 cepas houve 33 deleções de nucleotídeos, sendo que 24 ocorreram no último nucleotídeo do códon 4 (24,7%), o que caracterizou um novo alelo. Na região 2, dentre as 97 cepas não houve mutação em 16 - sete estavam associadas a ausência de mutação na região 1. Ocorreram 83 mutações pontuais, sendo 75,3% no códon 315. Sete cepas resistentes a INH não apresentaram mutações em nenhuma das duas regiões analisadas. As mutações na região 2 permitiram o diagnóstico de resistência à INH em 79 cepas ou 81,4%. Nove cepas que não mostraram mutações na região 2 tiveram mutações na região 1. Logo, esta região permitiu o acréscimo do diagnóstico de resistência à INH para 88 cepas, aumentando a positividade em 9,3%. Em sete casos resistentes não houve mutação em ambas as regiões. Na análise do gene rpoB usamos 120 cepas de MTb. Nenhuma mutação foi encontrada em 13 isolados resistentes à RMP. O códon que apresentou maior freqüência de mutação foi o 531 (45.6%), seguido pelo 526 (26%) e 516 (12.5%). Em outros onze códons, foi encontrado um total de 18 mutações (15.2%), principalmente nos códons 511 (3.4%) e 513 (3.4%). Nenhum dos isolados sensíveis à RMP apresentou mutações. No Estado do Rio de Janeiro, as mutações mais freqüentes foram: 516 (5%), 526 (2.5 %) e 531 (21.2%). Dentre os outros estados, as mutações mais freqüentes foram: 516 (2.5 %), 526 (11%) e 531 (19.4%). A freqüência de mutações dos isolados do Rio de Janeiro foi comparada com a encontrada nos outros estados, mas quando o removemos da análise, a freqüência de mutações nos códons 531 e 526 para os outros 15 estados é semelhante. A análise estatística mostra que este dado é significativo (p=0.002). No entanto, quando todos os estados são analisados simultaneamente, o códon 531 é novamente o mais freqüentemente mutado. A análise do gene rpoB diagnosticou a resistência à rifampicina em 89,17% das cepas. Nossos resultados confirmam que, no Brasil, mutações na região RRDR do gene rpoB podem predizer resistência a RMP.

Tuberculosis (Tb) is the main cause of death in the world due to a infectious pathogenic agent. The standard treatment is chemotherapy: rifampicin (RMP), isoniazid (INH), and pyrazinamide (PZA). One of the most serious global problems is the increase in the occurrence of multidrug resistant <i>M. tuberculosis</i> (MTb) strains, resistant to, at least, INH and RMP. Resistance to INH and RMP generally occurs by gene mutations in the KatG and rpoB genes, respectively. There are two objectives in this thesis: 1- To analyze the type and frequencies of mutations in two different regions of the katG gene; 2- To determine the type and frequency of rpoB gene mutations. Two regions of the KatG gene and one of the rpoB gene were amplified by PCR, and sequenced to identify the mutations. For the analysis of the katG gene 101 strains were used. Among them, 4 were sensitive and showed no mutation (controls). Among the 97 remaining, in the first sequenced region of the katG gene, no mutations occurred in 67. Thirty cases had 33 nucleotide deletions, with 24 deletions at codon 4 (24.7%), which characterized a new allele. In region 2, 16 strains had no mutations - seven were associated with a lack of mutations in region 1. There were also 83 mutations, 73 in codon 315 (75.3%). Seven INH-resistant strains showed no mutations in any of the two regions analyzed. Mutations in region 2 allowed the diagnosis of INH resistance in 79 strains or 81.4%. Nine strains which showed no mutations in region 2 had mutations in region 1. This means that the analysis of this region allowed the increase in INH resistance diagnosis for 88 strains (90.7%), increasing the positive rate in 9.3%. In seven cases, there were no mutations associated with resistance in any of the regions. In the rpoB analysis 120 MTb strains were used. No mutations were found in 13 RMP resistant isolates. The codon with the highest mutation frequency was 531 (45.6%), followed by 526 (26%) and 516 (12.5%). In other eleven codons, a total of 18 mutations were found (15.2%), mainly at codons 511 (3.4%) and 513 (3.4%). None of the RMP sensitive isolates showed any mutations. In the State of Rio de Janeiro, the most frequent mutations were: 516 (5%), 526 (2.5%) and 531 (21.2%). Within the other states, the most frequent mutations were: 516 (2.5%), 526 (11%) and 531 (19.4%). The frequency of mutations at codons 516, 526 and 531 from the Rio de Janeiro isolates was compared with those found in other states. When Rio de Janeiro was removed from the analysis, the frequency of mutations at codons 531 and 526 for the other 15 states was similar. The statistical analysis shows that this data is significant (p = 0.002). However, when all states were analyzed together, the codon 531 is again the most frequently mutated. The analysis of the rpoB gene diagnosed RMP resistance in 89.17% of the strains. Our results confirm that, in Brazil, mutations in the RRDR of the rpoB gene are good predictors of RMP resistance.