Análise e identificação de produtos do catabolismo de heme nas formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, α-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina.

Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, α-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.