Estudo das alterações biológicas causadas pela aderência de cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias.

Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.