Efeito da 1,10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis

Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis

Leishmaniasis is a group of diseases with a wide spectrum of clinical manifestations, which range from self-limited skin lesions to severe visceral involvement that can lead to death. Leishmaniasis is still a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on drugs that cause serious side effects, and are unaffordable in several endemic countries. Metal-based drugs represent a novel antimicrobial and anti-cancer therapeutics arsenal. Peptidase inhibitors/chelating agents such as 1,10-phenanthroline and its substituted derivatives, either the metal-free state or as ligands coordinated to transition metals, interfere with crucial functions of several biological systems. In previous works, our group described that L. braziliensis produced gp63 molecules sensible to 1,10-phenanthroline. Herein, we initially studied the cellular distribution of gp63 in a virulent strain of L. braziliensis by biochemical and immunocytochemical analyses. After that, we reported the inhibitory effects of three 1,10-phenanthroline derivative compounds, 1,10-phenanthroline-5,6-dione (phendio), [Cu(phendio)2]and [Ag(phendio)2], on both cellular and extracellular metallopeptidase activities produced by L. braziliensis promastigotes as well as their actions on the parasite viability and on the interaction with murine macrophage cells. The gp63 molecules were detected in several parasite compartments, including cytoplasm, membrane lining the cell body and flagellum, and flagellar pocket. The treatment of L. braziliensis promastigotes for 1 hour with 1,10-phenanthroline and its derivatives resulted in a significant inhibition of cell viability and showed an irreversible mechanism of action. These metallopeptidase inhibitors induced apoptosis in L. braziliensis promastigotes as judged by annexin/propidium iodide staining and TUNEL assays. The pre-treatment of promastigotes with metallopeptidase inhibitors induced a reduction on the expression of surface gp63 as well as a significant reduction on the association index with macrophages. In parallel, the treatment of L. braziliensis-infected macrophages with the 1,10-phenanthroline and its derivatives promoted a powerful reduction on the number of intracellular amastigotes. The treatment of macrophage cells with 1,10-phenantroline and its derivatives did not induce nitric oxide production. A synergistic inhibition on the growth ability was observed when 1,10-phenanthroline derivative compounds and Glucantime were used at sub-inhibitory concentrations. In vivos the compounds 1,10-phenanthroline derivatives and its were able to control the lesions size from the third week of treatment on, when compared to untreated control infected hamsters. The animals treated with the compounds showed greater response to the intradermal antigens of L. braziliensis. Collectively, the 1,10-phenanthroline and its metal-based drugs present a good perspective for prospective studies to the development of new anti-L. braziliensis drugs