Identification of collagenolytic MMP networks as potential biomarkers in progressive chronic periodontitis subjects and MMP-8 null allele model

Chronic periodontitis results from a complex aetiology, including the formation of a subgingival biofilm and the elicitation of the host s immune and inflammatory response. The hallmark of chronic periodontitis is alveolar bone loss and soft periodontal tissue destruction. Evidence supports that periodontitis progresses in dynamic states of exacerbation and remission or quiescence. The major clinical approach to identify disease progression is the tolerance method, based on sequential probing. Collagen degradation is one of the key events in periodontal destructive lesions. Matrix metalloproteinase (MMP)-8 and MMP-13 are the primary collagenolytic MMPs that are associated with the severity of periodontal inflammation and disease, either by a direct breakdown of the collagenised matrix or by the processing of non-matrix bioactive substrates. Despite the numerous host mediators that have been proposed as potential biomarkers for chronic periodontitis, they reflect inflammation rather than the loss of periodontal attachment. The aim of the present study was to determine the key molecular MMP-8 and -13 interactions in gingival crevicular fluid (GCF) and gingival tissue from progressive periodontitis lesions and MMP-8 null allele mouse model. In study (I), GCF and gingival biopsies from active and inactive sites of chronic periodontitis patients, which were determined clinically by the tolerance method, and healthy GCF were analysed for MMP-13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP)-1. Chronic periodontitis was characterised by increased MMP-13 levels and the active sites showed a tendency of decreased TIMP-1 levels associated with increments of MMP-13 and total protein concentration compared to inactive sites. In study (II), we investigated whether MMP-13 activity was associated with TIMP-1, bone collagen breakdown through ICTP levels, as well as the activation rate of MMP-9 in destructive lesions. The active sites demonstrated increased GCF ICTP levels as well as lowered TIMP-1 detection along with elevated MMP-13 activity. MMP-9 activation rate was enhanced by MMP-13 in diseased gingival tissue. In study (III), we analysed the potential association between the levels, molecular forms, isoenzyme distribution and degree of activation of MMP-8, MMP-14, MPO and the inhibitor TIMP-1 in GCF from periodontitis progressive patients at baseline and after periodontal therapy. A positive correlation was found for MPO/MMP-8 and their levels associated with progression episodes and treatment response. Because MMP-8 is activated by hypochlorous acid in vitro, our results suggested an interaction between the MPO oxidative pathway and MMP-8 activation in GCF. Finally, in study (IV), on the basis of the previous finding that MMP-8-deficient mice showed impaired neutrophil responses and severe alveolar bone loss, we aimed to characterise the detection patterns of LIX/CXCL5, SDF-1/CXCL12 and RANKL in P. gingivalis-induced experimental periodontitis and in the MMP-8-/- murine model. The detection of neutrophil-chemoattractant LIX/CXCL5 was restricted to the oral-periodontal interface and its levels were reduced in infected MMP-8 null mice vs. wild type mice, whereas the detection of SDF-1/CXCL12 and RANKL in periodontal tissues increased in experimentally-induced periodontitis, irrespectively from the genotype. Accordingly, MMP-8 might regulate LIX/CXCL5 levels by undetermined mechanisms, and SDF-1/CXCL12 and RANKL might promote the development and/or progression of periodontitis.

Kroonisen parodontiitin etiologia on monisyinen käsittäen subgingivaalisen biofilmin muodostumisen ja isännän immuuni- ja tulehdusvasteen aktivoitumisen. Kroonisen parodontiitin tunnusmerkkejä ovat alveolaariluun menetys ja parodontaalisen, suurelta osin kollageenisäikeisen, pehmytkudoksen palautumaton tuhoutuminen. Nykykäsityksen mukaan parodontiitin eteneminen voi tapahtua dynaamisesti vaiheittain, ja parodontiumin tulehtuminen voi paheta tai pysähtyä, mutta se ei palaudu. Kliinisesti parodontiumin tulehdusastetta/ sairausvakavuutta arvioidaan pääsääntöisesti mittaamalla ientaskujen syvyydet ja kiinnitystasoa. Lukuisissa tutkimuksissa elimistön tulehduksen välittäjäaineita/ kudostuhoentsyymejä on ehdotettu parodontiitin potentiaalisiksi biomarkkereiksi, mutta nämä eivät suoranaisesti määritä parodontaalisen kiinnityskudoksen menetystä vaan useimmiten pikemminkin tulehduksen voimakuutta. Kollageenin hajoaminen on yksi keskeisimpiä tapahtumia parodontaalisessa kudostuhossa. Matriksin metalloproteinaasi (MMP)-8 ja MMP-13 ovat tehokkaimpia isäntäperäisiä kollageenisäikeitä pilkkovia MMP:itä ja nämä kollagenaasit-2 (MMP-8) ja -3 (MMP-13) vaikuttavat parodontiitin vaikeusasteeseen. Näiden kollagenaasien on havaittu tuhoavan joko suoraan kollageenista soluväliainetta, matriksia tai aktivoivan ja inaktivoivan proteolyyttisesti bioaktiivisia tulehduksen välittäjäaineita, esim. sytokiineja, kemokiineja ja kasvutekijöitä. Tässä tutkimuksessa keskityimme näiden keskeisten parodontaalisairaudessa esiintyvien kollagenaasien MMP-8 ja MMP-13 vuorovaikutuksiin ientaskunesteessä ja ienkudoksessa etenevässä parodontiitissa sekä MMP-8 poistogeenisessa hiirimallissa. Ensimmäisessä osatyössä analysoimme MMP-13 ja MMP:n kudosestäjän-1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1) esiintymistä ientaskunesteissä ja ienkudosnäytteissä, jotka oli kerätty henkilöiltä, joiden parodontiitin tulehdustila määriteltiin toleranssi-menetelmällä (tolerance-method) eteneväksi/ aktiiviseksi ja pysähtyneeksi/ inaktiiviseksi. Parodontiitin aktiivisuuden määrittäminen perustui kliiniseen statuksen pitkittäistutkimukseen, jossa aktiivisen/ etenevän parodontiitin omaavalla koehenkilöllä havaittiin ≥ 2 mm muutos 2 kk aikana. Lisäksi tutkimukseen kerättiin näytteitä terveen parodontaalisen statuksen omaavilta henkilöiltä. Tutkimustuloksemme osoittivat lisääntynyttä MMP-13 pitoisuutta ja aktivaatiota kroonisessa aktiivisessa/ etenevässä parodontiitissa verrattuna inaktiiviseen. Aktiivisessa eli etenevässä vaiheessa olevien parodontiittipotilaiden korkeisiin MMP-13 pitoisuuksiin ja aktiivisuuteen liittyi alhainen TIMP-1 pitoisuus verrattuna inaktiivisessa eli pysähtyneessä vaiheessa olevien parodontiittipotilaiden löydöksiin. Toisessa osatyössä tutkimme oliko MMP-13 aktiivisuus liittyneenä TIMP-1:een ja alveolaariluun hajoamista heijastavan kollageenin I tyypin hajoamispeptidin (carboxyterminal telopeptide of type I collagen, ICTP) pitoisuuteen. Tutkimuksemme osoittivat aktiivisessa/etenevässä vaiheessa olevassa parodontiitin ientaskunesteessä kohonneita ICTP pitoisuuksia ja MMP-13 aktiivisuutta, kun taas TIMP-1 tasot olivat alhaiset. Samalla osoitimme MMP-13 vaikuttavan proMMP-9 aktivoitumiseen parodontiittisessa ienkudoksessa viljelykokeen avulla. Kolmannessa osatyössä analysoimme potentiaalista yhteyttä MMP-8, MMP-14, myeloperoksidaasin (MPO) ja TIMP-1 pitoisuuksien, molekyylimuotojen ja aktiivisuusasteiden kesken ientaskunesteissä, jotka oli kerätty etenevää parodontiittia sairastavilta henkilöiltä ennen ja jälkeen parodontaalisen hoidon. Tuloksena havaitsimme positiivinen korrelaation MPO/MMP-8 suhteessa ja niiden pitoisuudet korreloivat parodontiitin pahentumiseen/etenemiseen kuin myös hoitovasteeseen. Koska hypokloriitin (HOCl) tiedetään hapettamalla vaikuttavan (oxidative pathway) koeolosuhteissa MMP-8 aktivoitumiseen, havaitsimme, että MPO oksidatiivisesti aktivoi MMP-8:aa ientaskunesteessä. Neljäs osatyö perustui tutkimusryhmämme aiempiin havaintoihin MMP-8 poistogeenisillä hiirillä esiintyvään heikentyneeseen nk. neutrofiilivasteeseen ja huomattavaan alveolaariluun menetykseen. Tarkoituksemme oli kartoittaa mm. neutrofiilien kemokiinina toimivaa LIX/CXCL5 ja myös luusolujen, erityisesti osteoklastien, toimintaan vaikuttavien kemokiinien (SDF-1/CXCL12 ja RANKL) esiintymistä parodontiitissa aiheuttamalla parodontiitti MMP-8 poistogeenisille hiirille tartuttamalla eläimet tunnetulla parodontiittipatogeenilla, Porphyromonas gingivaliksella. Havaintomme neutrofiilejä kemokiinisesti houkuttelevasta (chemoattractive) LIX/CXCL5 esiintymisestä olivat vähäisemmät MMP-8 poistogeenisillä hiirillä verrattuna nk. villityypin hiiriin. Taas SDF-1/CXCL12 ja RANKL esiintyminen lisääntyivät Porphyromonas gingivaliksen tartunnan saaneilla hiirillä genotyypistä riippumatta. Näin ollen, MMP-8 saattaa eritoten säädellä LIX/CXCL5 tasoja vielä tuntemattomilla mekanismeilla. Tutkimuksemme vahvistavat entisestään MMP-8 ja MMP-13 keskeistä osuutta parodontiitissa ja siten niitä voi hyvin pitää potentiaalisina biomarkkereina etenevän parodontiitiin seurannassa. Tutkimusryhmämme on kehittänyt MMP-8:lle tuolinvierustestin (MMP-8 Periomarker®) parodontiitin diagnostiikan avuksi. Näiden kollagenolyytisten MMP:iden pitoisuuksien ja vuorovaikutuksien syvempi tuntemus omalta osaltaan johtaa etenevän parodontiitin parempaan diagnostiikkaan ja monipuolisten hoitomuotojen kehittämiseen mm. farmakologian saralla. Tähän väitöskirjaan johtanut tutkimustyö on tehty Helsingin yliopiston hammaslääketieteen laitoksella.